研究背景铁的主要生理功能是造血，当人体内缺乏铁时，会发生贫血、免疫力低、无力、头痛、口腔炎、易患感冒和肝癌等。但是当人体内铁过量时，则会因不能及时排出体外而沉积于肝脏、胰腺、心脏和皮肤从而引起血色病（血色素沉积）、肝功能异常、心肌损伤和糖尿病。人们可由于大量食用铁强化食品，特别是由于膳食结构的改变和工业污染等原因，从而通过各种途径使进入体内的铁增加。尤其是铁过量所造成的肝脏损害已受到许多学者的重视，有关的研究也日益增多。因为肝脏是铁沉积的主要脏器，铁作为一种强有力催化剂，促进氧自由基的产生，导致肝细胞亚细胞膜磷脂过氧化损伤，特别是在线粒体和微粒体膜的损伤，通过干扰电子转移而导致能量减少，最终使细胞死亡而继发肝纤维化的形成。微量元素硒在人和动物体内的吸收、代谢、运转、分布等规律受肝脏制约，硒是GSH-Px的必需组成部分，GSH-Px能催化还原型谷胱苷肽变成氧化型谷胱苷肽，同时使有毒的过氧化物（ROOH）还原成无害的羟基化合物，并使H₂O₂分解，因而可以保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的损害和干扰。目的过量的铁对肝脏具有损伤作用，而微量元素硒作为一种有毒金属的拮抗剂，对于铁具有拮抗作用。以往有人用亚硒酸钠进行实验，但这种无机硒的毒副作用大。本实验选用富硒酵母作为拮抗剂来代替亚硒酸钠进行实验研究，是因为酵母是人类利用最广的微生物，其蛋白质含量高达50％以上，还含有丰富的B族维生素和多种矿物质，被称为优质营养之源，并且具有高度的富硒能力及将化学硒转化为生物硒的能力，大大消除了亚硒酸钠作为一种化学硒对生物体所产生的毒副反应和胃肠刺激。以往研究表明，它能够更高效、更安全地被生物体吸收利用。因此，富硒酵母可以适当的作为一种保健品添加到我们的日常食物当中，以此对患有此类疾病人群的肝脏起到一定的保护作用。方法整个实验分为两个部分。第一部分：小鼠高铁模型的建立。实验动物为昆明小鼠，采用喂以普通全价颗粒饲料辅以定期定量腹腔注射右旋糖酐铁，快速建立高铁动物模型并观察动物体内铁水平的高低、脏器系数的改变、肝脏的病理损伤及其体内的脂质过氧化水平。具体造模方法如下：将40只昆明小鼠随机分为两组，对照组10只，高铁模型组30只，其中高铁模型组又分为低、中、高三个剂量组。将两组小鼠雌雄分养于塑料不锈钢笼内，室内温度（23±3）℃且昼夜分明，相对湿度50％～60％，自由进食，喂以去离子水。实验之前先适应此环境三天，并称各组小鼠体重、测定血清铁浓度。于第四天开始实验，低剂量组、中剂量组和高剂量组小鼠继续饮用去离子水，并分别以不同浓度的右旋糖酐铁稀释液隔日腹腔注射，0.8mL／次（铁稀释液中所含铁量分别为6.25mg／mL，12.5mg／mL和25mg／mL）；对照组小鼠则改用饮自来水并隔日腹腔注射生理盐水，0.8mL／次，连续注射6周。每周测定血清铁浓度和称量体重，观察小鼠的一般状况。6周末，将所有小鼠处死，解剖。用原子吸收光谱法和全自动生化仪分别测定各脏器和血清中铁的含量，并做肝脏病理组织学检查，计算肝脏和脾脏的脏器系数。测定血清中MDA的含量以及SOD的活性。第二部分：富硒酵母对铁过量导致小鼠肝损伤保护作用的实验研究。将50只小鼠随机分为五组，其中对照组10只，隔日腹腔注射生理盐水，0.8mL／次；补充铁剂组40只，右旋糖酐铁稀释液隔日腹腔注射，0.8mL／次（铁稀释液中所含铁量为12.5mg／mL），连续注射4周。4周之后，将补充铁剂组的40只小鼠再随机分为四组，分别为：单纯补充铁剂的模型组10只，Fe+20mgSey的低剂量组10只，Fe+40mgSey的中剂量组10只和Fe+60mgSey的高剂量组10只。此时将对照组每天以蒸馏水灌胃并隔日腹腔注射生理盐水，0.8mL／次；模型组每天以蒸馏水灌胃并隔日腹腔注射右旋糖酐铁稀释液，0.8mL／次（铁稀释液中所含铁量为12.5mg／mL）；其余三组处理组则分别以20mg／（kg·d），40mg／（kg·d），60 mg／（kg·d）浓度的富硒酵母混悬液给予每天灌胃，并辅以隔日腹腔注射右旋糖酐铁稀释液，0.8mL／次（铁稀释液中所含铁量为12.5mg／mL），连续注射和灌胃4周。4周末，将所有小鼠处死，解剖。分别测定血清ALT、AST的酶活性；肝脏脂质过氧化水平；肝组织损伤的病理改变和肝细胞凋亡的变化以及采用反转录一聚合酶链反应（RT—PCR）技术检验肝脏中IRP—2 mRNA、TfRmRNA的表达水平。结果第一部分：小鼠高铁模型的建立。1．高铁小鼠的一般状况：肤色：与对照组比较，高铁模型组小鼠在实验第3周开始出现皮毛粗糙、稀疏，毛色失去光泽，耳、脚爪、尾巴均出现明显的色泽改变，呈渐深的铁锈色，牙齿呈黄褐色，并随着实验的时间延长上述症状更加明显。行为改变：随着实验的进行，高铁模型组小鼠生长缓慢，身体消瘦。表现出倦怠，活动减少，反应迟钝，怕冷嗜睡蜷缩成团，易受惊吓，饮食明显减少。2．各组小鼠肝、脾脏器系数的比较：高铁模型组小鼠肝、脾脏器系数与对照组比较明显升高，差异具有显著性（P＜0.01）。3．各脏器铁含量及血清铁浓度的比较：高铁模型组小鼠的各脏器铁含量和血清铁浓度与对照组比较均有明显升高（P＜0.01），且都随注射剂量的增加而升高，但心脏中的铁含量在低剂量组和中剂量组之间比较差异无显著性，（P＞0.05）。各主要脏器中肝脏内铁的沉积量最大，心脏最少，沉积情况依次排列如下：肝脏＞脾脏＞肾脏＞肺脏＞心脏。4．血清SOD活性和MDA含量的比较：高铁模型组小鼠血清中SOD的活性与对照组比较明显降低（P＜0.01），并随给药剂量增加有逐渐降低的趋势。高铁模型组小鼠血清中MDA含量与对照组比较均明显升高（P＜0.01）。5．各组小鼠肝脏病理组织学检查：小鼠肝脏病理学检查表明过多的铁可以损伤细胞，使细胞排列紊乱、边界不清，发生水样变性、坏死等病理改变，且在汇管区程度较重，这可能与铁的分布有关。铁染色分析结果显示，实验组肝脏内含铁物质增多，光镜下可见染成蓝色的铁存在，且随剂量的增加而分布广泛。在低剂量组肝脏内的铁分布均匀，而在中、高剂量组则汇管区铁含量明显高于中央静脉区。第二部分：富硒酵母对铁过量导致小鼠肝损伤保护作用的实验研究。1．不同浓度富硒酵母对小鼠铁过量导致肝脏损伤ALT、AST活性变化情况：ALT活性的改变：与模型组比较，中、高剂量组的ALT活性呈明显下降趋势，差异极显著（P＜0.01），低剂量组的ALT活性虽有所下降，但无明显差异（P＞0.05）；与正常对照组比较，低剂量组和高剂量组的ALT活性均逐渐上升，具有显著性差异（P＜0.01），而中剂量组的ALT活性虽有所上升，但差异不显著（P＞0.05）。结果证明，加入中、高剂量的Sey，对ALT活性有明显的改善作用；而低剂量的Sey则无改善作用。其中，加入中剂量的Sey，对于ALT改善的效果最优。AST活性的改变：与模型组比较，低剂量组的AST活性呈下降趋势，差异显著（P＜0.05），中、高剂量组的AST活性显著下降，具有极显著差异（P＜0.01）；与正常对照组比较，低、中、高三个剂量组的AST活性均有上升，具有显著差异（P＜0.01）。结果证明，加入低剂量的Sey，对小鼠铁过量导致肝脏损伤的AST活性有显著的改善作用，加入中、高剂量的Sey，对AST活性有极显著的改善作用。各剂量间相互比较，可知，中剂量组改善效果最为明显，低剂量最差，高剂量次之。2．不同浓度富硒酵母对肝组织MDA含量、SOD活力、CAT活力和GSH-PX活性变化情况的检测：本实验的研究结果表明在本实验设定的浓度范围内，随着Sey浓度的升高，小鼠肝匀浆MDA的生成量较模型组呈下降趋势，具有显著性差异（P＜0.05）。其中，低Sey浓度组的MDA生成量较中、高剂量组降低更为明显。肝匀浆SOD活性的变化趋势则同MDA含量变化趋势相反，随着Sey浓度的升高，SOD的活性较模型组呈显著性上升趋势（P＜0.05）。其中，低Sey浓度组SOD活性最高，中、高剂量组次之，三组改善组之间比较发现，低剂量组和高剂量组之间具有显著性差异（P＜0.05），但是低剂量和中剂量、中剂量和高剂量之间的差异并无统计学意义（P＞0.05），说明低剂量的Sey改善效果最好。肝匀浆CAT的活性在随着Sey浓度升高以后，较模型组相比逐渐呈上升趋势，具有显著性差异（P＜0.01）。其中，中Sey浓度组CAT活性最高，低、高剂量组次之，说明．Sey在达到高浓度时抗氧化能力可能开始减弱，CAT活性逐渐呈下降趋势。肝匀浆GSH-PX活性在随着Sey浓度升高之后，低、中剂量组较模型组相比呈上升趋势，其中低剂量组的GSH-PX活性上升更为明显，具有显著性差异（P＜0.05）；而高剂量组和模型组之间的差异则无统计学意义（P＞0.05）。3．不同浓度富硒酵母对肝脏病理切片的光镜观察：在补充过量的铁剂所导致的肝脏损害中，最显著的特征是肝细胞中存在异常多的棕色色素（含铁血黄素沉积），经Schmeltzer法染色后呈现明显的蓝色，且分布广泛，此外还有增多的结缔组织。光镜下可见细胞核消失，有的细胞出现点状坏死，坏死灶内有炎性细胞浸润，汇管区有多处凝固性坏死灶，出现核固缩、溶解，大量细胞水样变性。在补充了富硒酵母之后，可见蓝色的铁沉积明显减少，其中，中剂量组在减少铁沉积现象的中效果最明显，低、高剂量组次之。4．不同浓度富硒酵母对肝组织凋亡的影响：AO／EB荧光双重染色结果示：模型组呈现出大量中、晚期凋亡细胞和少量死亡细胞。而富硒酵母中剂量组细胞胞核大多呈均匀绿色荧光，有极少量橙红色凋亡细胞，与正常对照组相近，而富硒酵母高剂量组则与模型组相近。5．不同浓度富硒酵母对肝组织IRP-2 mRNA和TfR mRNA表达的影响：在建立高铁小鼠模型和改善较好的小鼠的基础上，对肝脏组织IRP-2 mRNA和TfR mRNA表达水平进行检测，结果表明随着铁剂量的增加，IRP-2 mRNA和TfR mRNA表达均下降，经富硒酵母改善后，IRP-2 mRNA和TfR mRNA表达有所增强，经中剂量改善后的小鼠肝脏基因表达较模型组均有显著性上调（P＜0.01），而低、高剂量的富硒酵母改善效果较差。由此说明适当剂量的硒可以改善小鼠肝脏的基因表达，且IRP-2在转录水平通过调节TfR mRNA的表达影响肝脏铁的储存，是体内铁代谢的重要调节者。