MicroRNAs(miRNAs)是一类具有转录后调控功能的单链小分子非编码RNA,能够通过与靶mRNA特异性的碱基互补配对引起靶mRNA的降解或者抑制其翻译,从而对基因进行转录后表达调控。MiRNAs广泛存在于各物种中,并参与调控生物的生长发育、细胞增殖与分化、细胞凋亡与癌变等。在昆虫领域,miRNA被发现参与昆虫的免疫应激及变态发育等调控。然而,miRNA数据库miRBase中已被注释的物种仅有26种,仍有大量的miRNAs未被发现。此外,由于miRNAs具有时序性的表达特征,许多与发育相关的miRNAs仍然需要进一步鉴定。因此,为了探讨miRNAs在昆虫变态发育、翅的发育、雌雄异型发育、胚胎发育等过程中的作用,本研究利用Solexa高通量测序、微流体生物芯片实验、RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术、miRNAs模拟物及拮抗剂等系统性的研究,得到以下重要的研究成果:1、中华真地鳖(Eupolyphaga sinensis Walker)也叫土元,是一种雌雄异型发育的半变态昆虫,也是重要的中药药材。雄性土元较之雌性具有更短的生命周期及龄期,并且雄性有翅而雌性无翅。对健康的四龄若虫雌雄样本分别进行高通量二代测序总共得到19,097,799条原始序列:7,817,445条序列来自雌性样本,11,280,354条序列来自雄性样本。本研究在土元中首次鉴定了 372条miRNAs,分别是168条已知及204条潜在新的miRNAs。其中,100条miRNAs为雄性特有,32条miRNAs为雌性特有,而240条为雌雄两性共有。差异表达分析显示在雌雄共有表达miRNAs中,45条高丰度miRNAs在雌雄中具有差异表达,如let-7-5p,miR-184,miR-8,miR-9a等,并通过定量PCR进行了验证。结合前期功能研究,这些miRNAs的鉴定表明miRNAs与雌雄异形发育及翅的形成有关,为进一步对昆虫雌雄异型发育及翅的形成的功能研究奠定了基础。2、目前,虽然在赤拟谷盗(Tribolium castaneum)中已经鉴定了部分miRNAs,但由于miRNAs具有时期特异性仍有大量miRNAs有待发现且其功能研究在赤拟谷盗物种中尚未起步。为了探讨miRNAs在昆虫翅的形成机制及变态发育中的作用,本研究在赤拟谷盗晚期幼虫时期对miRNAs形成通路关键基因Dicer-1和Ago-1进行RNAi分析,发现Dicer-1和Ago-1干扰后影响和阻断了赤拟谷盗的变态发育进程。变态发育相关联miRNAs:let-7,miR-8,miR-100,miR-184的表达在处理组显著降低,证明miRNAs在其中扮演重要作用。然而由Dicer-1和Ago-1敲减后的表型不可能由单个miRNA个体削减后结果产生的,必定是多个miRNA参与到复杂的调控网络中。为探讨其对变态发育的直接调控,首先对处理组中直接影响变态发育的保幼激素通路及蜕皮通路关键基因检测,结果表明处理组上调了保幼激素受体Met及其下游基因Kr-h1的转录水平,下调了Br-c及E74的转录水平。其次,对这4个基因的作用miRNA预测发现了 11条miRNAs靶向Met的22个位点;14条miRNAs 靶向Kr-h1的28个作用位点,表明miRNAs直接参与赤拟谷盗变态发育。为了更广泛地发现赤拟谷盗miRNAs,本研究进一步对赤拟谷盗八个生长发育进行高通量测序,探索新的miRNAs。结果得到12,259,974条原始reads,其中能比对上的有7,116,806条,这里面miRNAs的reads则是2,175,311条。经过生物信息学分析,共发现1154条赤拟谷盗miRNAs,其中包含274条保守miRNAs;108条已知候选miRNAs;和772条潜在新的miRNAs。基因组定位分析显示赤拟谷盗miRNAs在基因组上存在大量的miRNA基因簇,因定位相近而聚集,并且其分布密度大于其他物种。此外,在赤拟谷盗中发现许多miRNAs个体具有多个异构体,为miRNAs的复制进化模式提供素材。3、目前的研究显示一些miRNA个体是调控昆虫变态发育的重要因子,然而,究竟有多少miRNAs还参与到变态发育以及其他的发育中还需进一步研究。结合前期研究得到的赤拟谷盗miRNAs及miRBase里所有的节肢动物2308条miRNAs一起合成生物探针,进行微流体芯片实验。分析得到179条miRNAs在赤拟谷盗5个发育时期(早期胚胎,晚期幼虫,早期蛹,晚期蛹,早期成虫)中具有差异表达并通过聚类分析分别归到9个聚类中(A-I)。其中,有5个聚类为时期特异表达miRNA簇,分别是早期胚胎、晚期幼虫、早期成虫高表达簇;早期蛹、早期胚胎低表达簇。进一步生物信息学分析发现,有2个miRNA簇引人注目,分别是簇A和簇F。簇A中包含53个胚胎时期特异高表达miRNAs具有747个候选靶基因,只显著富集到8个GO功能组分上;而簇F中包含5个早期蛹时期特异低表达的miRNAs具有234个候选靶基因,却显著富集到65个GO功能组分上,其中许多靶基因关联着器官发育及组织形成功能组分和信号通路,暗示miRNAs或许对胚胎发生的调控网络中通过候选靶基因进行更特异的调控作用,而对变态发育早期蛹的组织及器官形成的调控网络中通过候选靶基因进行更广泛的调控作用。为进一步验证miRNAs对赤拟谷盗发育的调控作用,对直接靶向保幼激素受体Met及其下游基因Kr-h1的5个时期差异表达miRNAs成员(miR-6-3p,miR-9a-3p,miR-9d-3p,miR-11-3p 及 miR-13a-3p)进行体内功能缺失性研究,发现这些miRNAs削减后可显著上调Met及Kr-h1及下调Vg的表达,特异拮抗后阻碍蜕皮、影响翅的发育等,密切关联赤拟谷盗的变态发育及生殖。本研究筛选鉴定了在赤拟谷盗胚胎发育及变态发育过程中存在差异表达的重要调控miRNAs,并进一步进行了体内功能验证,表明这些miRNAs直接或间接参与调控,为后续对昆虫的生长发育及变态发育研究提供基础。4、miR-8是昆虫特异miRNA,目前在果蝇的研究中表明其参与了昆虫的发育与免疫,而在其他的物种中的作用还有待发掘,并且在赤拟谷盗中尚未研究。为了进一步验证miRNAs对昆虫发育的调控作用,选取了在土元有翅雄性高丰度表达及在赤拟谷盗变态发育中差异表达的miR-8进行功能研究,探讨miR-8在变态发育中昆虫翅的形成、器官的形成及后期的发育的调控作用。本研究中显示miR-8在赤拟谷盗晚期幼虫及早期成虫中高表达,在幼虫组织脂肪体及成虫脑、表皮中富集,对赤拟谷盗的晚期幼虫进行miR-8特异拮抗剂anta-8的显微注射后,可导致赤拟谷盗的体型显著变小,翅型的变小。此外产生约50%的不正常表型,包括翅、眼、腿部的发育缺陷,在变态发育过程中产生畸形蛹及成虫;产卵质量下降,卵的发育不良、后代发育不良等。结合生物信息学及miRNA-mRNA的相互验证实验,鉴定了 miR-8的靶基因wingless、Eyg、Fpps、Sema-1a。这些结果表明,miR-8可通过其靶基因广泛参与到变态发育中赤拟谷盗翅、眼、腿的发育调控网络中。