黑穗醋栗叶片中黄酮类化合物的提取、分离纯化及生物活性的研究

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黑穗醋栗(R.nigrum L.)俗称黑豆果,为黑龙江寒地特色小浆果,其叶片富含黄酮类化合物。本研究以黑穗醋栗叶片为对象,在研究其黄酮类化合物最佳提取工艺基础上,系统研究了黄酮类化合物分离纯化、鉴定及生物活性,以期为黑穗醋栗产业化生产提供支撑。在提取工艺中,采用响应面方法对超声波溶剂提取条件进行优化。确定最佳理论条件:超声时间30min,超声功率517W,液料比15.2:1mL/g,此条件下理论预测黄酮提取量4.6916mg/g,实际操作条件:超声时间30min,超声功率520W,液料比15:1mL/g。在此条件下黄酮提取量达4.5891mg/g,与预测值4.6916mg/g很接近。在纯化工艺中,采用大孔树脂为吸附材料进行纯化。通过静态试验比较六种大孔树脂对黑穗醋栗叶黄酮吸附与解吸效果,筛选出三种大孔树脂NKA-9、D4020、D101-1,并通过吸附与解吸动力学试验,确定NKA-9为黑穗醋栗叶黄酮纯化大孔树脂。通过NKA-9对黑穗醋栗叶黄酮动态吸附与解吸试验得到最佳条件:在25℃下,吸附流速1mL/min(浓度为0.9311mg/mL),吸附时间1h,进样量60mL,洗脱剂为无水乙醇,洗脱流速1mL/min,洗脱时间100min,洗脱量100mL。在此条件下黑穗醋栗叶片黄酮纯度可达40.15%,与纯化前(9.53%)比较,纯度提高4倍以上,可见NKA-9大孔树脂纯化效果很好。在分离工艺中,引入葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱对大孔树脂纯化后的黄酮进行分离。用无水甲醇溶液进行洗脱,洗脱流速为1.0mL/min,通过HPLC检测(色谱条件为:色谱柱:Agilent-1100C18;流动相:甲醇:水(50:50);流速:1.0mL/min;检测器:Agilent-G1314A紫外检测器;检测波长:360nm;温度:室温),得到精黄酮。通过HPLC检测结果表明,黑穗醋栗叶中所含的黄酮类物质以芦丁为主,纯度为86.37%。在黄酮活性试验中,探讨了黄酮对蛋白质体外非酶糖基化的抑制作用,清除羟基自由基能力。结果表明,抑制作用随着黄酮浓度增加而增加;处理后第三天出现最大抑制率,61.89%。清除羟基自由基能力,随着黄酮浓度增加而增大,当黄酮浓度达到1.18mg/mL,清除率达到65.4%,IC50为0.875mg/mL.
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