目的:观察益气解毒活络方对高脂高糖饲料喂养联合链脲佐菌素(STZ)腹腔注射诱导的早期糖尿病肾病(DN)大鼠相关药效学指标、肾脏病理形态学的影响,及药物作用机制指标的变化,从ERK1/2信号通路途径探讨益气解毒活络方对早期DN防治作用的可能的分子机制。材料与方法:健康Wistar大鼠(SPF级)雌雄各45只,体重(280±20)g,以普通饲料适应性喂养1周后,准确称取体质量,按大鼠体质量分层随机分为正常组10只、造模组80只,均雌雄各半。正常组大鼠以普通饲料继续喂养,造模组大鼠以高脂高糖饲料喂养1周后,禁食不禁水12h,准确称量体质量,按42mg/kg标准单次腹腔注射STZ溶液;正常组大鼠则以等量枸橼酸缓冲液腹腔注射。STZ溶液腹腔注射72h后,尾静脉测空腹血糖(FBG),以FBG≥16.7 mmol/L者认为是DM造模成功,其中血糖不达标者8只,剔除实验。将72只DM成模大鼠按血糖水平重新随机分为模型对照组16只,西药对照组14只,中药预防组14只,中药高剂量组14只,中药低剂量组14只,继续高脂高糖饲料喂养,自由饮水。根据相关文献,按照自然病程发展,2周后出现早期DN,并结合尿微量白蛋白测定结果,将DN模型建立成功者纳入正式实验。实验干预的益气解毒活络方由免煎中药配方颗粒剂组成:黄精(40g)、黄芪(40g)、黄连(6g)、虎杖(30g)、泽兰(20g)、水蛭粉(6g)。西药对照药选用盐酸贝那普利片(洛汀新,10mg/片)。预防组在DM模型成功后立即灌胃,给药量按人体(g/kg)-大鼠等效剂量的6.3倍计算;西药组、高量组、低量组大鼠均在DN模型成功后开始灌胃,西药组、低量组给药量按人体(g/kg)-大鼠等效剂量的6.3倍计算;高量组按低量组的3倍。正常组、模型组灌胃等量生理盐水,灌胃体积均为10m L/kg,每日1次,预防组灌胃10周,其余各组灌胃8周。在实验期间,各组大鼠自由饮食水,不予任何降糖药物及胰岛素。治疗结束后,准确称量体质量,留取尿液标本,麻醉后腹主动脉穿刺采血,留取全血、血浆、血清标本,分别检测空腹血糖、糖化血红蛋白、尿微量白蛋白、血β2微球蛋白、血尿素氮、血肌酐、全血粘度、血浆纤维蛋白原水平;光镜下观察肾组织HE、PAS染色病理改变;酶联免疫吸附法检测血浆及肾组织血管紧张素Ⅱ、前列腺素E2的含量;实时荧光定量PCR法检测各组大鼠肾组织结缔组织生长因子m RNA表达;蛋白印记法检测肾组织结缔组织生长因子、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表达的水平。结果:1.各组大鼠一般情况比较正常组大鼠全程无死亡,皮毛光泽,一般状态较好,饮水量、进食量及小便量正常,麦粒状大便;模型组大鼠出现明显的多食、多饮、多尿、消瘦症状,大便溏不成形,一般状态差,有不同程度的脱毛、尾部溃烂、眼病等并发症;各治疗组上述症状有所减轻。实验过程中共死亡8只大鼠。2.各组大鼠药效学指标的比较2.1各组大鼠体质量的比较2周(DN成模)时,各组大鼠体质量无明显差异,无统计学差异(p>0.05);10周(取材)时,与正常组比较,模型组大鼠体质量明显下降,统计学差异明显(p<0.01);与模型组比较,各治疗组大鼠体质量明显增加,以西药组大鼠体质量增加最明显,有统计学差异(p<0.05);其它各治疗组大鼠体质量与模型组大鼠体质量无统计学差异(p>0.05);与预防组比较,各治疗组大鼠体质量无明显差异,无统计学差异(p>0.05)。提示实验药物可预防早期DN模型大鼠体质量的下降。2.2各组大鼠空腹血糖的比较2周(DN成模)时,与正常组比较,模型组大鼠血糖明显升高,统计学差异明显(p<0.01);各治疗组大鼠血糖与模型组比较,无明显差异,不具有统计学差异(p>0.05);10周(取材)时,与正常组比较,模型组大鼠血糖明显升高,统计学差异明显(p<0.01);与模型组比较,各治疗组大鼠血糖明显降低,统计学差异明显(p<0.01),其中以预防组降低最明显;与预防组比较,其它各治疗组大鼠血糖升高,其中西药组、低量组大鼠血糖与预防组大鼠血糖统计学差异明显(p<0.01),高量组大鼠血糖与预防组大鼠血糖有统计学差异(p<0.05)。提示实验药物可降低DN模型大鼠的血糖,且以早期干预效果最好。2.3各组大鼠糖化血红蛋白、β2-MG的比较与正常组比较,模型组大鼠糖化血红蛋白明显升高,统计学差异明显(p<0.01);与模型组比较,各治疗组大鼠糖化血红蛋白明显降低,统计学差异明显(p<0.01);其中,以预防组大鼠糖化血红蛋白降低最明显,但与其他各治疗组比较,无统计学意义(p>0.05)。提示实验药物可降低DN模型大鼠的糖化血红蛋白,以预防组效果最好。与正常组比较,模型组大鼠血β2-MG明显升高,统计学差异明显(p<0.01);与模型组比较,各治疗组大鼠血β2-MG明显降低,统计学差异明显(p<0.01);各治疗组大鼠血β2-MG组间无统计学意义(p>0.05)。提示实验药物可降低DN模型大鼠血β2-MG水平。2.4各组大鼠血BUN、Scr的比较与正常组比较,模型组大鼠血BUN明显升高,统计学差异明显(p<0.01);与模型组比较,各治疗组大鼠血BUN明显降低,统计学差异明显(p<0.01);各治疗组大鼠血BUN组间无统计学意义(p>0.05)。各治疗组中,低量组大鼠尿素氮与正常组有统计学差异(p<0.05),其它各治疗组大鼠尿素氮与正常组无统计学差异(p>0.05)。各组大鼠血Scr无明显变化,各组间无统计学意义(p>0.05)。2.5各组大鼠尿微量白蛋白的比较2周(DN成模)时,与正常组比较,各造模组大鼠尿微量白蛋白明显升高,统计学差异明显(p<0.01);但各造模组大鼠组间尿微量白蛋白无明显差异,无统计学差异(p>0.05)。10周(取材)时,与正常组比较,模型组大鼠尿微量白蛋白明显升高,统计学差异明显(p<0.01);与模型组比较,各治疗组大鼠尿微量白蛋白明显降低,统计学差异明显(p<0.01),其中以预防组降低最明显;与预防组比较,其他各治疗组尿微量白蛋白明显升高,统计学差异明显(p<0.01)。提示实验药物可降低DN模型大鼠尿微量白蛋白水平,以预防组效果最好。3各组大鼠肾组织病理形态学比较HE染色:正常组大鼠肾组织未见明显病理变化,肾小球、肾小管及系膜基质形态、结构正常,管壁薄厚及管腔大小正常;模型组大鼠肾组织肾小球硬化,系膜细胞及系膜基质增生,血管球萎缩,管壁薄厚不均,有不同程度的肿胀,管腔大小不一,部分肾小管上皮细胞空泡变性;各治疗组上述病理改变有不同程度的减轻。PAS染色:正常组大鼠肾组织球、管形态及结构正常,PAS染色为阴性;模型组大鼠呈现弥漫性肾小球病变,个别肾小球荒废,部分肾小球内偶见结节,肾小动脉玻璃样变,系膜基质增多,基底膜增厚,PAS染色阳性物质广泛集中于小叶中央部;各治疗组上述病理改变明显减轻,以预防组病变较轻,肾小管及基底膜无明显病变,肾小球系膜基质轻度增多;西药组大鼠肾小管萎缩,系膜基质明显增多,弥漫性肾小球硬化;高量组大鼠肾小球基底膜及肾小管无明显病变,肾小球基底膜及系膜基质增多;低量组大鼠基底膜增厚,系膜基质增多,肾小球节段性硬化。4.各组大鼠药物作用机制指标的比较4.1各组大鼠全血粘度比较与正常组比较,模型组大鼠全血粘度明显升高,统计学差异明显(p<0.01);与模型组比较,各治疗组大鼠全血粘度明显降低,统计学差异明显(p<0.01);其中,以预防组大鼠全血粘度降低最明显。与预防组比较,西药组、低量组大鼠全血高切粘度升高,统计学差异明显(p<0.01),高量组大鼠全血高切粘度升高不明显,无统计学意义(p>0.05);西药组、高量组大鼠全血中切粘度较预防组升高,但无统计学意义(p>0.05),低量组大鼠全血中切粘度较预防组升高,统计学差异明显(p<0.05);西药组、低量组大鼠全血低切粘度较预防组升高明显,统计学差异明显(p<0.01),高量组大鼠全血低切粘度较预防组升高,有统计学意义(p<0.05)。提示实验药物可降低DN模型大鼠的全血粘度。4.2各组大鼠血浆FIB的比较与正常组比较,模型组大鼠血浆FIB明显升高,统计学差异明显(p<0.01);与模型组比较,各治疗组大鼠血浆FIB明显降低,统计学差异明显(p<0.01);其中,以预防组血浆FIB降低最明显。与预防组比较,西药组大鼠血浆FIB升高,有统计学意义(p<0.05),高量组大鼠血浆FIB升高不明显,无统计学意义(p>0.05),低量组大鼠血浆FIB升高明显,统计学差异明显(p<0.01)。提示实验药物可降低DN模型大鼠的血浆FIB,以预防组效果最好。4.3各组大鼠血浆及肾组织AngⅡ的比较与正常组比较,模型组大鼠血浆、肾组织中血管紧张素Ⅱ含量明显升高,统计学差异明显(p<0.01);与模型组比较,各治疗组大鼠血浆、肾组织中血管紧张素Ⅱ含量明显降低,统计学差异明显(p<0.01);与预防组比较,西药组、高量组大鼠血浆中血管紧张素Ⅱ含量升高,低量组大鼠血浆中血管紧张素Ⅱ含量降低,但均无统计学差异(p>0.05);西药组、高量组大鼠肾组织中血管紧张素Ⅱ含量较预防组升高明显,统计学差异明显(p<0.01),低量组大鼠肾组织中血管紧张素Ⅱ含量较预防组升高不明显,无统计学差异(p>0.05)。提示实验药物可降低DN模型大鼠的AngⅡ含量。4.4各组大鼠血浆及肾组织PGE2的比较与正常组比较,模型组大鼠血浆及肾组织PGE2明显升高,统计学差异明显(p<0.01);与模型组比较,各治疗组大鼠血浆及肾组织PGE2明显降低,统计学差异明显(p<0.01);与预防组比较,西药组、高量组大鼠血浆中PGE2含量升高,低量组大鼠血浆中PGE2降低,但均无统计学差异(p>0.05);西药组、高量组大鼠肾组织中PGE2较预防组升高明显,统计学差异明显(p<0.01),低量组大鼠肾组织中PGE2较预防组降低不明显,无统计学差异(p>0.05)。提示实验药物可降低DN模型大鼠的PGE2含量。4.5各组大鼠肾组织CTGF m RNA及蛋白表达的比较正常组大鼠肾组织中CTGF m RNA少量表达,与正常组比较,模型组大鼠肾组织CTGF m RNA表达明显升高,统计学差异明显(p<0.01);与模型组比较,各治疗组大鼠肾组织CTGF m RNA表达明显降低,统计学差异明显(p<0.01);其中,以预防组降低最明显。与预防组比较,其他各治疗组大鼠肾组织CTGF m RNA表达明显升高,统计学差异明显(p<0.01)。正常组大鼠肾组织匀浆可见少量CTGF蛋白表达,与正常组比较,模型组大鼠肾组织匀浆CTGF蛋白表达明显升高,统计学差异明显(p<0.01);与模型组比较,各治疗组大鼠肾组织匀浆CTGF蛋白表达明显降低,统计学差异明显(p<0.01);其中,以预防组降低最明显。与预防组比较,其他各治疗组大鼠肾组织匀浆CTGF蛋白表达明显升高,统计学差异明显(p<0.01)。上述结果提示,实验药物可降低DN模型大鼠肾组织CTGF m RNA及蛋白表达,以预防组效果最好。4.6各组大鼠肾组织ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达的比较与正常组比较,模型组大鼠p-ERK1/2蛋白表达明显升高,统计学差异明显(p<0.01);与模型组比较,各治疗组大鼠p-ERK1/2蛋白表达明显降低,统计学差异明显(p<0.01),其中以预防组效果最好;与预防组比较,其他各治疗组大鼠p-ERK1/2蛋白表达升高,统计学差异明显(p<0.01)。各组大鼠ERK1/2蛋白表达差异没有统计学意义。提示实验药物可降低DN模型大鼠肾组织p-ERK1/2蛋白表达,以预防组效果最好。结论:1.益气解毒活络方能够改善DN大鼠的一般状况,降低尿微量白蛋白的排泄,对早期DN大鼠的FBG、β2-MG均有明显改善作用。2.益气解毒活络方防治早期DN的作用机制可能是通过降低AngⅡ水平,调节ERK1/2信号转导通路实现的。