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目的本研究旨在探索表皮生长因子（Epidermal Growth Factor,EGF）对初级感觉神经元轴突生长的影响,探讨增强成年初级感觉神经元内在生长能力对于脊髓后索损伤后感觉功能恢复的影响;同时在体外实验及体内试验通过调控初级感觉神经元中miR-22-3p水平,阐明miR-22-3p在初级感觉神经元轴突生长和脊髓感觉传导功能中的作用,进而找到促进脊髓损伤后轴索再生的关键靶点和治疗方法。方法1.体外培养初级感觉神经元,使用EGF、小干扰RNA（siRNA）、miR-22-3p mimics、AG490、Ruxolitinib等药物处理初级感觉神经元,以期观察神经元轴突生长差异和细胞内部信号通路蛋白的表达水平。2.使用NF-200免疫荧光染色方法对体外培养的初级感觉神经元轴突进行标记和计算其长度,比较EGF、siRNA、miR-22-3p mimics、AG490、Ruxolitinib等对初级感觉神经元轴突生长的影响。3.使用免疫印迹实验测定磷酸化表皮生长因子受体（phosphorylated Epidermal Growth Factor Receptor,p-EGFR）、Casitas B细胞淋巴瘤（Casitas B-lineage lymphoma,CBL）、信号转导与转录激活因子3（Signal Transducer and Activator of Transcription 3,STAT3）、磷酸化信号转导与转录激活因子3（phosphorylated Signal Transducer and Activator of Transcription 3,p-STAT3）、细胞外调节蛋白激酶1/2（Extracellular Regulated Protein Kinases1/2,Erk1/2）、磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2（phosphorylated Extracellular Regulated Protein Kinases1/2,p-Erk1/2）、生长相关蛋白43（Growth Associated Protein 43,GAP43）和磷生长相关酸化蛋白43（phosphorylated Growth Associated Protein 43,p-GAP43）的表达水平,以期探索参与到EGF促进初级感觉神经元轴突生长过程的细胞内部信号通路。4.使用Targetscan、StarBase、miRDB和miRwalk database对潜在靶向CBL蛋白的miRNA进行生物信息学预测。使用双荧光素酶报告实验验证miR-22-3p与CBL mRNA3’端非编码区的相互作用。使用实时荧光定量聚合酶链反应（RTqPCR）对miR-22-3p、CBL mRNA进行检测,评价miR-22-3p对CBL表达的抑制作用。5.建立脊髓后索损伤模型,同时使用miR-22-3p模拟物（Agomir）进行DRG注射,在体内水平使用免疫印迹实验检测损伤后关键蛋白EGF、p-EGFR、CBL、p-STAT3和p-GAP43的表达水平,验证在体内调控miR-22-3p是否同样可以调控CBL/p-EGFR/p-STAT3/GAP43/p-GAP43通路。6.使用体感诱发电位（Somatosensory Evoked Potentials,SSEP）和胶带移除实验（Tape Removal Teat,TRT）对脊髓后索损伤后大鼠脊髓上行感觉传导通路完整性和大鼠后肢感觉功能进行检测,从而评价调控DRG中miR-22-3p水平对脊髓后索损伤后感觉功能损伤的修复效能。结果1.EGF促进初级感觉神经元轴突生长EGF处理初级感觉神经元30min和1h相较于处理0min,轴突长度显著增长,但是30min与1h组无明显差异。提示延长EGF处理时间不会进一步促进初级感觉神经元轴突生长。p-EGFR的表达在EGF处理30min时发生上调,但是在延长处理时间至1h时,其表达相较于30min时下调。与30min组相比,1h组p-EGFR水平的降低并没有改变神经元轴突的生长。2.CBL敲减后增加p-EGFR的表达使用CBL siRNA敲减CBL后,CBL的蛋白表达水平显著下调,证实CBL siRNA的敲减效能。敲减CBL后,p-EGFR的表达水平显著升高,提示CBL是抑制p-EGFR表达的关键靶点。3.miR-22-3p是CBL的靶miRNA通过四个数据库预测可以靶向CBL的miRNA,miR-22-3p是其中被四个数据库同时预测到的miRNA。双荧光素酶报告实验证实miR-22-3p可以靶向CBL m RNA 3’端非编码区。RT-qPCR证实miR-22-3p mimics增加miR-22-3p在神经元中的表达,并且可以减少靶向下调CBL mRNA表达。4.miR-22-3p促进p-EGFR表达和初级感觉神经元轴突生长miR-22-3p mimics能够明显降低CBL蛋白的表达。在下调CBL的同时,可以显著上调p-EGFR蛋白表达。提示miR-22-3p mimics解除了CBL对p-EGFR的抑制作用。NF-200细胞免疫荧光染色证实miR-22-3p mimics可以显著促进初级感觉神经元轴突生长。5.p-STAT3/GAP43/p-GAP43信号通路是p-EGFR主要的下游通路为了验证p-EGFR下游的具体信号通路,Erk1/2,p-Erk1/2,STAT3,p-STAT3,GAP43和p-GAP43的表达水平进行检测。在所有时间点STAT3、Erk1/2和pErk1/2蛋白表达无差异。p-STAT3,GAP43和p-GAP43的表达水平在30 min和1 h组显著上调。提示p-STAT3/GAP43/p-GAP43通路是p-EGFR细胞内下游通路。6.p-STAT3/GAP43/p-GAP43信号通路是miR-22-3p/CBL/p-EGFR调节初级感觉神经元轴突生长主要的下游通路miR-22-3p显著促进初级感觉神经元轴突生长,而AG490抑制剂（EGFR与JAK抑制剂）与鲁索替尼（STAT3抑制剂）显著抑制miR-22-3p mimics作用。同时,miR-22-3p mimics对p-STAT3和p-GAP43的促进作用被上述两种抑制剂抑制。证实p-STAT3/GAP43/p-GAP43是miR-22-3p/CBL/p-EGFR轴下游调控轴突生长的主要通路。7.miR-22-3p在体内调控CBL/p-EGFR/p-STAT3/GAP43/p-GAP43信号通路在后索损伤造模后7、14和28 d,EGF、p-EGFR和miR-22-3p的表达量呈现先下调再逐渐上调的表达趋势。当在体内使用miR-22-3p Agomir后,CBL的表达受到显著抑制,p-EGFR、p-STAT3和p-GAP43的表达显著上调。证实miR-22-3p可以在体内调控CBL/p-EGFR/p-STAT3/GAP43/p-GAP43信号通路。8.miR-22-3p促进脊髓后索损伤后传导功能恢复使用SSEP和TRT检测大鼠脊髓后索损伤后脊髓感觉传导功能,结果证实miR-22-3p Agomir可以在一定程度上恢复感觉诱发电位和胶带移除实验的表现。证实miR-22-3p可以促进脊髓后索感觉传导功能恢复。结论1.CBL是限制EGF促进成年初级感觉神经元轴突生长的主要原因。2.miR-22-3p可以通过靶向抑制CBL从而上调p-EGFR和下游STAT3/GAP43/pGAP43信号通路来促进初级感觉神经元轴突生长。3.调控miR-22-3p/CBL/p-EGFR/p-STAT3/GAP43/p-GAP43信号通路轴可以促进脊髓后索损伤感觉传导功能恢复。