目的 尼古丁(Nicotine的音译名)，又叫烟碱，是烟草中的主要生物碱，是主流烟气中具有毒性的粒相成分。现已公认，孕妇接触尼古丁会对胎儿的发育造成多种不良影响，如自发性流产、围产儿发病率和死亡率增加、低体重出生儿等早期暴露的不利影响，此外还会引发后代的晚期神经行为损害，如认知障碍、注意力涣散、学习和记忆能力低下、低智商以及行为异常等，这些症状提示尼古丁对中枢神经系统的正常发育有一定的影响。根据流行病学调查，目前我国是世界第一吸烟大国，约有吸烟人口3亿，在我国，孕妇接触尼古丁的机会相当多，这无疑会对提高人口素质产生不利影响。孕妇接触尼古丁的主要途径包括主动吸烟和被动吸烟等。尼古丁为脂溶性，可以迅速从血浆进入细胞内，很易通过胎盘，并在胎儿体内蓄积，影响胎儿正常发育。因此，阐明尼古丁对神经系统发育的作用机制，对提高人口素质具有重要现实意义。 目前，学者们多是从神经递质系统的角度研究尼古丁引发脑发育异常的作用机制。有文献报道，尼古丁能增强胎脑中胆碱能系统的活性，过早地刺激细胞由分裂增殖转向分化，破坏脑细胞增殖和分化的协调性；胆碱能系统的活性过高还促进P53、c-fos等基因的表达，引起细胞凋亡增多和细胞延缓性丢失；尼古丁还可使儿茶酚胺类和血清素类递质系统包括多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)和5-羟色胺(5-HT)等的合成、释放和代谢活性加强，可能与兴奋性神经精神症状的产生有关。 迄今为止，尼古丁影响脑发育的某些现象用已有的结论还不能完全解释清楚。如，有研究显示，尼古丁能抑制小鸡睫状神经节神经元和PC12细胞突起的生长；Britto等向鸡卵中注射尼古丁1mM，3天后，发现鸡胚顶盖胆碱能神经元的树突长度较对照组明显变短，同时在其它脑区及体外培养的顶盖细胞中也发现了类似的现象；Slotkin等对宫内暴露尼古丁的大鼠脑切片进行观察，发现海马CA3区和齿状回的细胞层厚度下降，体感皮层(somatosensory cortex)第5层的中等体积锥体神经元数目减少，伴有体积较小的非锥体细胞增加，并且所有被测脑区中都发现胶质细胞数量增加。以上现象提示，尼古丁不仅破坏细胞增殖与分化的协调性，还对脑发育中正常的细胞分裂后事件有干扰作用，诸如神经细胞突起生长及细胞迁移、识别等过程。有文献报道，尼古丁对神经细胞生长的干扰作用与其破坏细胞内钙离子浓度动态平衡有关，然而目前关于尼古丁干扰分裂后事件的作用机制尚未阐明。 曾有报道神经细胞钻附分子(NCAM)在中枢神经系统发育中具有广泛的作用，它通过同亲性及异亲性结合介导细胞与细胞及细胞与细胞外基质间的相互作用，参与细胞的迁移、分化、识别，调节神经细胞轴突的生长、导向和成束，参与细胞信号转导及突触重塑、学习和记忆等过程。如NCAM介导了视网膜和小脑细胞层次的形成，以及神经岭细胞迁移等。而且，体内和体外实验均显示，对NCAM分子的功能和/或表达的干扰都能引起形态学改变。最近有研究表明，将小鼠NCAM一180基因敲除可导致神经细胞迁移障碍和海马细胞组织结构发生精细变化，并且，基因敲除小鼠表现出全脑体积减小以及持久的空间学习障碍。根据以上研究中NCAM在中枢神经系统发育中的作用，我们推测NCAM可能参与尼古丁对脑发育的影响过程。目前尚无这方面的报道。 NCAM属细胞勃附分子免疫球蛋白超家族，是表达于大多数脊椎动物和无脊椎动物中枢神经系统和外周神经系统细胞表面的糖蛋白。在胚胎发育早期，当神经上皮向内折叠形成神经管及神经峪时NCAM开始表达，并在分化的神经元、胶质细胞及肌细胞表面稳定表达。在中枢神经系统，NCAM主要以180、140和120Kda分子量形式出现，这三种形式的NCAM来自于同一基因转录后的不同剪接方式。糖基化NCAM主要存在于胚胎期和早期新生动物脑内以及成年脑内具高水平结构重塑的局部区域，如嗅觉系统和海马组织的苔鲜纤维系统，以多聚唾液酸化NCAM(PSA一NCAM)报道较多，其作用主要为通过电荷排斥降低细胞豁附性，促进细胞迁移和突触重塑。 本研究以小鼠大脑皮层和海马为主要研究对象，拟建立暴露尼古丁的动物模型和细胞模型，采用免疫组织化学法、Westem blot和RT一PCR等方法，进一步观察尼古丁对大脑皮层和海马形态结构的发育过程的影响，初步探讨在脑发育中尼古丁对NCAM表达模式的影响及其作用机制。以期为阐明尼古丁影响大脑皮层与海马形态发生的作用机制提供科学依据。方法 一、建立妊娠期宫内暴露尼古丁的小鼠动物模型 二、HE染色法观察生后21天小鼠大脑皮层和海马的组织结构变化 三、免疫组织化学法观察生后21天小鼠NCAM的表达 四、蛋白质免疫印迹(Westem blot)法检测小鼠在出生后不同发育阶段NCAM的表达情况 五、建立暴露尼古丁的细胞模型及免疫细胞化学法鉴定细胞成分 1.胚胎18天(E18)小鼠大脑皮层细胞原代培养 2.神经元特异性烯醇化酶(NSE)是神经元的特异性分子，用以鉴定神经元;胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是神经胶质细胞的特异性分子，用以鉴定?