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研究目的：1、研究EJ细胞单抗KMP1的结合抗原CD44的变化和KMP1对EJ细胞生物学功能的影响。2、研究EJ细胞中CD44基因小RNA干扰后细胞增殖、迁移功能以及其与特异性单抗KMP1结合力的改变。3、研究去糖基化后KMP1与抗原和EJ细胞结合性的改变,膀胱癌组织与正常膀胱粘膜中糖基转移酶的表达差异,EJ细胞中GALNTl基因小RNA干扰后细胞增殖、迁移和成瘤功能以及其与特异性单抗KMP1结合力的改变。研究方法：1、单克隆抗体KMP1的制备、抗原的鉴定及其抗膀胱癌功能的研究：采用人膀胱癌EJ细胞株免疫BALB/c小鼠,获得单抗KMP1,免疫荧光检测KMP1的亲和性、结合部位及效价。流式细胞检测KMP1对膀胱癌细胞的特异性。免疫组化检测对膀胱癌组织的特异性。亲和层析分离纯化特异性抗原,检测抗原的氨基酸序列。软琼脂培养克隆形成实验和细胞划痕实验检测KMP1对EJ细胞株的增殖和迁移功能的影响。鉴定EJ-GFP细胞的上皮肿瘤特性,种植于裸鼠皮下,荧光活体成像研究KMP1的体内抑制EJ细胞成瘤功能。2、CD44基因RNAi抑制EJ细胞迁移、增殖及其对KMP1结合力的影响：小RNA干扰的方法抑制EJ细胞中CD44基因表达,Western blot、ELISA和流式细胞仪检测EJ细胞与CD44特异性单抗KMP1的结合功能变化,细胞划痕实验和Boyden小室检测shCD44-EJ细胞的迁移功能,[3H]掺入法检测shCD44-EJ细胞的增殖能力。3、GALNT1基因沉默对单抗KMP1结合功能及EJ细胞生物学功能影响的研究：免疫组化检测过碘酸氧化后KMP1与抗原结合性的改变,流式细胞学检测糖基转化酶抑制剂作用后KMP1与EJ细胞结合性的改变,基因芯片技术研究膀胱癌组织与正常膀胱粘膜中糖基转移酶的表达差异,小RNA干扰的方法抑制EJ细胞中GALNT1基因表达,免疫细胞化学和流式细胞仪检测shGALNT1-EJ细胞与CD44特异性单抗KMP1的结合功能变化,Western blot检测shGALNT1-EJ细胞的CD44蛋白表达量,软琼脂培养克隆形成试验和[3H]掺入法检测shGALNTl-EJ细胞的增殖能力改变,细胞划痕实验和Boyden小室检测shGALNT1-EJ细胞的迁移功能改变,体内成瘤实验研究shCD44-EJ细胞和shGALNT1-EJ细胞的成瘤能力改变。研究结果：1、单克隆抗体KMP1的制备、抗原的鉴定及其抗膀胱癌功能的研究：获得的单抗KMP1是IgG1,能与EJ、BIU-87、T24膀胱癌细胞和膀胱癌组织特异性结合,而与Lovo. HeLa、K562、HepG2、Jurkat、293、HCV29、人的红细胞和白细胞无结合性,也不能结合正常膀胱粘膜。其结合EJ细胞的抗原是异常糖基化的CD44,软琼脂培养克隆形成实验和细胞划痕实验结果示KMP1还能减弱EJ细胞的增殖和迁移功能。KMP1能明显的抑制EJ-GFP细胞的体内成瘤。2、CD44基因RNAi抑制EJ细胞迁移、增殖及其对KMP1结合力的影响：shCD44-EJ细胞与KMP1的结合能力下降,CD44的表达量也降低,Wide type组和shCD44-EJ组的迁移到划痕中央的细胞数分别为257±32个和132±29个,shCD44-EJ组和Vector组细胞迁移到膜中和下室中的平均细胞数为356±13和672+17个,显示shCD44-EJ细胞的迁移能力较Wide type组和Vector组分别降低52%和53%,shCD44-EJ细胞的增殖活性是Vector组的73%。3、GALNT1基因沉默对单抗KMP1结合功能及EJ细胞生物学功能影响的研究：过碘酸氧化后Western blot显示KMP1对CD44结合性降低,糖基转化酶抑制剂BG作用EJ细胞7d后KMP1对EJ细胞结合性降低,基因芯片技术可见膀胱癌组织中GALNTl的表达量是膀胱正常粘膜的11.2倍,其他N-乙酰氨基半乳糖转移酶(GALNT2-9)和岩藻糖转移酶(FUT1-10)表达无差异。免疫细胞化学检测显示shGALNT1-EJ细胞与KMP1不结合,流式细胞学检测可见shGALNT1-EJ细胞与KMP1结合性减弱,Western blot检测shGALNT1-EJ细胞的CD44蛋白表达量明显低于只转染了Vector的EJ细胞,软琼脂培养克隆形成试验结果可见shGALNT1-EJ组细胞克隆数的是Vector组的75.5%,[3H]掺入法可见在72小时shGALNT1-EJ细胞的每分钟放射线脉冲数是Vector组的67.5%,细胞划痕实验可见在24h时shGLANT1-EJ细胞的平均迁移率为Wide type组EJ细胞的92.8%,Transwell实验可见shGLANT1-EJ细胞迁移到膜中和下室中的细胞为Vector组的87.8%,体内成瘤实验在第40天时shCD44-EJ细胞瘤体大小是Vector组的38.0%,shGALNT1-EJ细胞是Vector组的52.5%。研究结论：1、单克隆抗体KMP1的制备、抗原的鉴定及其抗膀胱癌功能的研究：膀胱癌的高复发性、易转移可能与出现异常糖基化的CD44高表达具有一定的相关性,KMP1可结合异常糖基化的CD44,并抑制EJ细胞的增殖和迁移。2、CD44基因RNAi抑制EJ细胞迁移、增殖及其对KMP1结合力的影响：特异性沉默CD44可降低EJ细胞与其特异性单抗KMP1的结合功能,并抑制EJ细胞的迁移和增殖能力。3.GALNT1基因沉默对单抗KMP1结合功能及EJ细胞生物学功能影响的研究：KMP1与去糖基化后的抗原和EJ细胞的结合性下降,膀胱癌中GALNTl呈高表达,特异性沉默GALNTl基因可降低EJ细胞与其特异性单抗KMP1的结合功能。膀胱癌中GALNTl呈高表达可能导致膀胱癌的CD44异常糖基化。并且,特异性沉默GALNTl基因可抑制EJ细胞的增殖和体内成瘤能力,但对EJ细胞的迁移能力影响较小