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牙鲆(Paralichthys olivaceus)作为珍贵的温带海洋性物种之一,由于其蛋白质含量较高,个体大,脂满味美且极易消化,具有很高的营养和经济价值,已经成为我国重要的海洋鱼类养殖品种。人工养殖中,雌鱼2年龄性腺发育成熟,雄鱼1年龄性腺就已发育完成,但鉴于雄鱼用于精巢发育所消耗的能量要比同时期还未性成熟的雌鱼多的多,加之性成熟后牙鲆雄鱼有近5个月的繁殖期,摄取的营养大多用于繁殖,在人工培育过程中雌鱼个体要明显大于雄鱼,所以通过性别控制来增加养殖产量成为重要的研究内容。因而相关的性别决定及性腺发育分子机制的研究也备受重视。牙鲆中已有不少关于性腺发育和分化相关基因的鉴定和功能分析报道,但此类基因的挖掘多集中于这些编码基因的表达规律和功能分析,对其转录后水平调控尤其是micro RNA(mi RNA)的研究鲜有报道。本实验室先前已建立了牙鲆精卵巢mi RNA文库,并通过第二代测序(NGS)技术和生物信息学方法鉴定了141个成熟mi RNA,筛选出一批在牙鲆雌雄性腺中差异或特异表达的mi RNA。在此基础上,本研究首先挑选了2个表达量较高且在精卵巢中显著差异表达的mi RNA(pol-mi R-26a,26b),采用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)法和原位杂交进行pol-mi R-26a,26b在牙鲆性腺中的表达分析,结果表明:pol-mi R-26a,26b在牙鲆成鱼的精巢中表达量相对最高,在牙鲆脑组织中也有较高的表达,但在卵巢中两者的表达量均显示相对较低。原位杂交定位显示:pol-mi R-26a,26b蓝紫色阳性信号明显成片状分布且多集中在成熟的精子细胞中分布在小叶腔内;而在成鱼卵巢中pol-mi R-26a,26b基因的阳性信号成稀少的片状分布,表达主要集中在V时相的卵母细胞及其细胞边缘的滤泡膜上。这些结果表明pol-mi R-26a,26b可能在牙鲆性腺的发育中发挥重要作用。mi RNA靶标的检测是研究mi RNA功能的重要环节。本实验利用Target Scan、Pic Tar和mi RBase等靶基因预测软件预测出pol-mi R-26a,26b有多个靶m RNA,挑选出了其中和鱼类性别决定和性腺分化相关的empty spiracles homeobox 2(emx2)基因,并进行了emx2基因鉴定和表达研究,该基因c DNA长1665bp,包含一段编码246个氨基酸残基的741bp的开放阅读框(ORF),一段12bp的5’-UTR区和一段912bp的3’-UTR区(Gen Bank accession number:KP260631)。氨基酸序列比对结果表明牙鲆Emx2与其他物种具有71-98%的高度同源性,且具有高度保守的emx2的经典同源框序列。Neighbor-Joining法(bootstrap 1000)构建的系统进化树表明牙鲆Emx2与硬骨鱼类同属于鲽形目的半滑舌鳎的Emx2聚为紧密的一支。不同组织和早期不同发育时期的定量PCR结果显示:牙鲆emx2基因在成鱼性腺中有很高的表达水平,且在卵巢中具有比精巢相对较高的表达水平,此外在脑组织中也有较高的表达。而在牙鲆胚胎早期发育阶段,牙鲆emx2基因在神经胚时期相对表达量最高。而在随后早期的胚胎发育和仔鱼生长时期emx2 m RNA的相对表达量逐渐降低。对比emx2基因和pol-mi R-26a,26b在牙鲆雌雄性腺中的表达,发现二者在牙鲆精卵巢的表达趋势恰好相反,这也暗示了emx2基因很可能是pol-mi R-26a,26b潜在的靶基因。为了进一步验证emx2基因是否为pol-mi R-26a,26b的靶基因,最后成功克隆了牙鲆emx2 3’-UTR区,对其与pol-mi R-26a,26b的结合位点进行了定点突变将GACTTGA突变为AGTCCAG,并构建了野生型和突变型的靶标报告载体;采用DLR双荧光素酶检测系统验证emx2基因与pol-mi R-26a,26b结合位点是否预测正确。结果表明:pol-mi R-26a,26b与野生型质粒psi CHECK-emx2-3’UTR共转染后,与空白组和阴性对照组共转染相比较,海肾荧光素酶(RL)/萤火虫荧光素酶(FL)活性明显降低,证明pol-mi R-26a,26b的“种子序列”与emx2 3’UTR的结合从而切割降解靶基因。pol-mi R-26a,26b inhibitor与野生型质粒psi CHECK-emx2-3’UTR共转染后,pol-mi R-26a,26b inhibitor海肾荧光素酶(RL)/萤火虫荧光素酶(FL)比值与blank、NC inhibitor比较P>0.05无统计学差异。表明细胞内源性pol-mi R-26a,26b表达量没有达到能阻碍其与emx2基因3’UTR结合而影响其荧光活性改变。而突变型质粒psi CHECK-mutated emx2-3’UTR与pol-mi R-26a,26b共转染后,海肾荧光素酶(RL)/萤火虫荧光素酶(FL)比值较之空白组和对照组均无显著性差异。从而证明由于位点的突变,pol-mi R-26a,26b缺失与emx2 3’UTR的结合能力从而无法发挥对靶基因的切割降解作用。因此,双荧光素酶报告实验表明牙鲆emx2基因是pol-mi R-26a,26b直接作用的靶基因,并为pol-mi R-26a,26b在牙鲆性腺发育中的调控提供了分子证据。