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目的分析本院高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent Klebsiella pneumoniae,hvKP）的检出情况、耐药性、黏液表型、毒力基因型、荚膜血清型以及多位点序列分型（Multilocus Sequence Typing,MLST）等,为本院hvKP感染的防控及精准诊疗提供依据;利用蛋白组学探索可区分hvKP与经典肺炎克雷伯菌（classic Klebsiella pneumoniae,c KP）的生物标志物;建立terE基因鉴别hvKP和c KP的方法学并对其性能进行评价,为临床微生物实验室鉴定hvKP的方法学选择提供参考。方法1.收集福建医科大学附属第一医院2019年3月至2019年8月临床分离的非重复411株肺炎克雷伯菌株,分别采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS）和Vitek 2 Compact全自动药敏检测系统进行菌株鉴定和药敏分析;利用PCR扩增4种常见毒力基因（iuc A、iro B、rmp A、rmp A2）和6种荚膜基因（K1、K2、K5、K20、K54、K57）;通过拉丝试验检测肺炎克雷伯菌的黏液表型;应用MLST分析60株hvKP菌株之间的同源性;收集121株hvKP感染患者的临床资料对其进行回顾性分析。2.筛选6株hvKP,3株c KP以及1株700603肺炎克雷伯菌质控菌株进行label-free蛋白组学检测,同时进行GO和KEGG富集等生物信息学分析,寻找差异蛋白及其相关功能信息;对上述筛选出的Ter E蛋白采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）进行验证,并通过构建p ET28 a（+）-terE过表达质粒诱导纯化Ter E蛋白,应用MALDI-TOF MS对其进行检测获取Ter E蛋白质谱峰。3.针对蛋白质组学结果,采用PCR方法对Ter E蛋白的编码基因terE进行检测,并用临床分离的411株肺炎克雷伯菌对其和拉丝试验的诊断性能进行评价,采用卡方检验和Cohen’s Kappa对其进行统计学分析。结果1.以4个毒力基因（iuc A、iro B、rmp A、rmp A2）全部阳性为hvKP鉴定标准,在411株肺炎克雷伯菌中筛选出121株hvKP（29.4%）和290株c KP（70.6%）,毒力基因检出率分别为iuc A 39.2%（161/411）、iro B 38.7%（159/411）、rmp A 37.7%（155/411）、rmp A2 30.9%（127/411）。121株hvKP中有104株荚膜血清型检测阳性,其中K1、K2、K5、K20、K54以及K57的检出率分别为35.5%（43/121）,28.1%（34/121）,5.0%（6/121）,3.3%（4/121）,5.8%（7/121）,8.3%（10/121）,此外,有14.0%（17/121）hvKP的荚膜血清型未知。411株肺炎克雷伯菌中拉丝试验阳性率为32.4%（133/411）,其中,hvKP中的阳性率为77.7%（94/121）,c KP中的阳性率为13.4%（39/290）。MLST分型结果表明,60株hvKP菌株可分为ST23、ST65、ST268、ST592、ST36、ST1049、ST202、ST218、ST29、ST374、ST1265、ST1764、ST355、ST412、ST86、ST889共16型,其检出率分别为35.0%（21/60）,16.7%（10/60）,8.3%（5/60）,8.3%（5/60）,5.0%（3/60）,3.3%（2/60）,3.3%（2/60）,3.3%（2/60）,3.3%（2/60）,3.3%（2/60）,1.7%（1/60）,1.7%（1/60）,1.7%（1/60）,1.7%（1/60）,1.7%（1/60）以及1.7%（1/60）,其中ST23型主要以K1血清型为主。药敏结果显示,hvKP菌株对大多数临床常用抗菌药物敏感,其对哌拉西林、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、头孢唑啉、头孢呋辛、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、头孢替坦、头孢呋辛酯、氨曲南、亚胺培南、美罗培南、妥布霉素、庆大霉素、阿米卡星、左旋氧氟沙星和环丙沙星的耐药率均低于c KP（P<0.001）。2.蛋白组学分析结果显示,与c KP相比,hvKP中有59个差异表达的蛋白,其中表达上调的蛋白有21个,包括Ter E、Ter Z、Ter F以及外膜蛋白等;表达下调的蛋白有38个,包括DNA损伤诱导蛋白D、2,3-二氢-2,3-二羟基苯甲酸酯脱氢酶、乙醇胺利用蛋白以及小热激蛋白等。hvKP和c KP差异表达蛋白质GO富集分析结果显示,差异蛋白主要与细胞组分,分子功能,生物过程有关;KEGG注释结果显示,差异蛋白主要参与果糖和甘露糖的代谢,氨基酸和核苷酸代谢,酮体的合成与降解等代谢途径。对筛选出的Ter E蛋白作为潜在生物标志物进行研究,Real-time PCR验证结果显示,hvKP和c KP组相比,terE m RNA的相对表达量显著增高（11293.93±11522.90 VS 0.80±0.67,P<0.0001）。通过p ET28a（+）-terE过表达质粒的构建和MALDI-TOF MS检测发现Ter E蛋白在11 k Da处存在相应的蛋白质谱峰。3.利用临床分离的411株肺炎克雷伯菌对拉丝试验以及terE基因检测法进行性能评价,发现拉丝试验鉴定hvKP的灵敏度为77.7%,特异度为86.6%,准确度为83.9%,阳性预测值为70.7%,阴性预测值为90.3%。对拉丝试验和参考方法进行一致性检验分析,其Kappa值为0.624,两者一致性一般。PCR检测分析发现411株肺炎克雷伯菌中terE基因的阳性率为35.0%（144/411）,其中hvKP中terE基因的携带率为95.9%（116/121）,c KP中terE基因的携带率为9.7%（28/290）。将terE基因检测作为判断高毒力肺炎克雷伯菌的指标,其灵敏度为95.9%,特异度为90.3%,准确度为92.0%,阳性预测值为80.6%,阴性预测值为98.1%。对terE基因检测法和参考方法进行一致性检验分析,其Kappa值为0.817,两种方法对hvKP的检测有较强的一致性。结论1.本院hvKP菌株的检出率为29.4%,其对大多数临床抗菌药物敏感性较高;临床分离的hvKP血清荚膜型主要为K1和K2血清型,ST分型主要以ST23型为主,其中ST23型hvKP以K1血清型为主。本研究揭示了我院hvKP的流行特点,为其溯源、防控以及临床诊疗奠定了理论基础。2.TerE蛋白有望成为hvKP鉴定的毒力标志物,利用MALDI-TOF MS检测TerE蛋白特异质谱峰,为KP检测和hvk P鉴别的同时完成提供了可能,但后续还需通过临床hvKP菌株进行性能验证;3.以临床分离的hvKP株对terE基因检测法进行性能评价,结果发现以其建立的方法学具有较高的灵敏度,特异度与准确度,可作为hvKP的鉴定方法。