论文部分内容阅读
为了探讨利用RNAi抑制病毒复制、增殖的效果,选取家蚕核型多角体病毒（BmNPV）对复制具有关键作用的极早期表达基因ie-1、解旋酶基因helicase以及对细胞释放型病毒（CRV）水平传播具有关键作用的病毒囊膜蛋白基因gp64为靶基因,体外合成了与其相对应的dsRNA,经脂质体转染家蚕BmN细胞,感染病毒粒子或共转染病毒基因组DNA,研究比较了供试dsRNA对BmNPV复制、增殖的抑制效果,探讨dsRNA分子大小以及同时抑制2个基因表达对病毒滴度的影响,筛选最佳标靶基因序列,为结合利用转基因技术和RNAi技术进行家蚕抗病毒研究提供依据。本文的主要研究内容如下: 一、ie-1基因相应dsRNA对家蚕核型多角体病毒复制增殖的抑制研究 根据BmNPV的ie-1基因序列,人工设计并体外合成了长度为438 bp的dsRNA,利用脂质体转染家蚕细胞,研究其对BmNPV复制增殖的抑制效果。结果表明该dsRNA能有效地抑制病毒DNA的复制,最大抑制效果是病毒滴度比对照降低了104.3倍:1μgdsRNA与BmNPV基因组DNA转染,处理区病毒增殖过程被完全抑制的有效作用时间是2d左右。 二、gp64基因相应dsRNA对家蚕核型多角体病毒复制增殖的抑制研究 根据BmNPV的gp64基因序列,人工设计并体外合成了分别位于gp64基因ORF前中后部的3个dsRNA片段G1、G2、G3（长度分别为459、508、337 bp）、以及G3片段进一步截短细分的3个dsRNA小片段G3-1、G3-2、G3-3（长度分别为122、105、109bp）,用BmN培养细胞研究供试dsRNA对BmNPV增殖的抑制效果并进行比较分析。结果表明6个供试dsRNA都能有效地抑制病毒DNA的增殖,3个长片段dsRNA的抑制效果没有明显差别,最大抑制效果为病毒滴度比对照降低了103.5倍左右,小片段dsRNA的抑制效果等于或高于大片段dsRNA。gp64基因相应dsRNA的病毒滴度抑制效果在感染后24h、96h最高,呈双峰型曲线,与推测的GP64蛋白在早期与晚期都有表达相一致。 三、解旋酶基因相应dsRNA对家蚕核型多角体病毒复制增殖的抑制研究 根据BmNPV的解旋酶基因helicase的序列,体外合成了长度为427 bp的dsRNA,经脂质体转染家蚕细胞后研究其对BmNPV复制的抑制效果。结果表明该dsRNA能有效地抑制病毒DNA的复制,最大抑制效果为病毒滴度降低了102.92倍。 四、抑制不同靶基因对家蚕核型多角体病毒增殖的抑制效果比较 在相同条件下,分别将ie-1、gp64、helicase的相应dsRNA（I1、G3、H1）转染BmN细胞,研究各dsRNA对BmNPV增殖的抑制效果并进行比较分析。结果表明3个dsRNA对病毒复制、增殖的抑制效果的大小顺序为I1>G3>H1,认为ie-1是利用RNAi技术抑制BmNPV复制增殖的最佳靶基因。利用dsRNA同时抑制ie-1、helicase 2个基因与抑制单个基因进行比较,表明同时抑制ie-1、gp64 2个基因的病毒滴度介于对2个基因单独抑制的病毒滴度之间,未发现协同增效作用。