第一部分AMPK(5’AMP-activated protein kinase)即AMP依赖的蛋白激酶,是生物能量代谢调节的关键分子。AMPK作为细胞能量感受器,其激活后可通过开启ATP的补偿机制和关闭ATP的消耗进程,恢复细胞内的能量平衡。AMPK参与调控多种细胞代谢进程,因此,其信号途径是研究肥胖、2型糖尿病等代谢性疾病的核心。AMPK的活性受到严格调控。当外界能量应激造成ATP减少,AMP/ATP比值增加,AMP可通过结合AMPKγ亚基,促进AMPK上游激酶(AMPKK)对AMPK第172位点的苏氨酸进行磷酸化,进而激活AMPK。当前,对AMPK激活调控多集中在对该位点的磷酸化修饰研究上,而其它类型的翻译后修饰是否参与AMPK的激活还未见报道。本实验室前期研究发现去泛素化修饰在AMPK激活过程中发挥重要作用,且鉴定了首个AMPK去泛素化酶USP10,同时发现USP10-AMPK通路受到精细的调控。因此,对USP10-AMPK信号通路的研究将为阐明AMPK信号通路的作用机制提供一条新的线索,具有非常重要的意义。本文的研究内容及结论主要包括以下两个方面:(一)USP10调控AMPKα泛素化及其活性。1)在AMPK激活剂AICAR刺激条件下,我们发现AMPK的激活伴随着其自身泛素化修饰水平的下降;2)通过生物信息学的方法分析USP10序列,我们鉴定了AMPKα上4个潜在泛素化位点。点突变实验证实这些位点的泛素化受到USP10调控;4)通过免疫印迹检测AMPK下游底物ACC1,Raptor的磷酸化,我们发现USP10的敲除抑制了AMPK的激活及其功能;油红O染色证明,USP10敲除导致脂滴形成显著提高;5)对USP10序列分析,我们发现USP10存在AMPK的潜在磷酸化位点Ser76。利用AMPK磷酸化通用底物抗体检测USP10磷酸化,我们发现能量应激上调胞内USP10的磷酸化;体外激酶实验进一步证明,AMPK可特异性磷酸化USP10;6)USP10敲除细胞中回补USP10野生型与S76突变体,实验证明USP10 S76位点的磷酸化促进其激活AMPK。(二)小鼠肝脏特异性敲除USP10导致多种代谢损伤。1)我们利用CRISPRCas9技术构建USP10肝脏特异性敲除小鼠模型,T7EN1酶切及免疫印迹检测USP10肝脏敲除效率;2)对小鼠表型检测,我们发现在肝脏内USP10的特异性敲除降低了AMPK的活性及其下游底物磷酸化。3)此外,USP10肝脏敲除小鼠表现出多种代谢缺陷,如甘油三酯、胆固醇及血糖含量明显升高。高胰岛素-正血糖钳夹实验证实,USP10敲除小鼠的葡萄糖灌注速率明显下调。综上所述,我们的研究发现了在能量应激下,一种放大AMPK激活信号的关键分子机制。我们发现AMPKα的泛素化会抑制其激活,而去泛素化酶USP10可以特异性的去泛素化AMPKα激活AMPK。在能量应激下,AMPK反过来磷酸化USP10丝氨酸76位点,提高USP10的活性。因此,AMPK与USP10之间形成一种反馈调控回路,确保能量应激下,AMPK激活信号的放大。小鼠敲除模型证明,对这种反馈调控回路的干扰,会导致AMPK的激活异常及多种代谢缺陷的发生。我们的研究揭示了泛素化修饰在AMPK活性调控中的新功能,进一步加深了我们对AMPK活性调控机制的理解,同时扩展了我们对于AMPK翻译后修饰新功能的认识。AMPK由于其重要功能已经成为肥胖,胰岛素抵抗,2型糖尿病,代谢综合征,甚至肿瘤等多种疾病的理想治疗靶点。AMPK激活剂如二甲双胍已经应用于胰岛素抵抗,2型糖尿病的临床治疗。鉴于USP10在AMPK激活中的重要作用,其有望为成为上述代谢性疾病的治疗靶标。第二部分c-ABL(Abelson tyrosine kinase)是一种非受体酪氨酸激酶,其可与bcr(breakpoint cluster region)基因发生融合突变,形成具有高度酪氨酸激酶活性的BCR/ABL融合蛋白。这种突变是造成慢性髓质白血病(CML)的根本原因。BCR/ABL酪氨酸激酶抑制剂(TKI)已经作为治疗慢性髓质白血病(CML)的一线药物。然而在临床治疗中,患者对imatinib及其它TKI的耐药性已成为CML治疗面临的新问题。当前,对imatinib耐药性潜在的分子机制还不十分清楚。本实验室前期研究发现有丝分裂调控蛋白PLK1(Polo-like kinase-1)是cABL的一个重要的激酶底物。c-ABL可以与PLK1相互作用并磷酸化PLK1,促进细胞周期进程及细胞增殖。同时,c-ABL介导的PLK1过表达与白血病患者的imatinib耐药性正相关。因此,对c-ABL-PLK1信号通路的研究不但可以进一步拓展人们对细胞周期调控机制的认识,而且可能为CML及其它肿瘤的治疗提供新的组合用药策略。本文的研究内容及结论主要包括以下四个方面:(一)c-ABL调控PLK1蛋白降解及其活性。我们发现c-ABL磷酸化PLK1,抑制其泛素化降解并提高其活性。1)利用免疫共沉淀与GST-pull down分析,我们证明c-ABL可以与PLK1在体内体外发生直接相互作用;2)通过找寻二者相互作用区域,我们发现PLK1通过PBD结构域与c-ABL结合;c-ABL通过SH2/SH3,PTKs结构域与PLK1相互作用;3)激酶磷酸化实验证明,c-ABL可以体内体外磷酸化PLK1;通过质谱鉴定,我们发现c-ABL磷酸化PLK1 Y217,Y425,Y445位点4)过表达c-ABL促进PLK1蛋白水平表达;敲除c-ABL抑制PLK1蛋白水平表达;利用放线菌酮阻抑证明c-ABL抑制PLK1降解;蛋白酶体抑制剂及泛素化实验证明,c-ABL抑制PLK1通过泛素化降解;点突变实验证明,c-ABL通过Y425位点调控PLK1蛋白稳定性;5)同步化细胞于有丝分裂期,我们证明c-ABL通过磷酸化PLK1 Y425位点促进PLK1的激活。体外磷酸化反应证明,PLK1 Y425位点的磷酸化促进Aurora A对其激活。(二)c-ABL磷酸化PLK1调控有丝分裂进程。1)流失细胞仪检测c-ABL敲低He La细胞,我们发现c-ABL影响细胞周期进程;2)免疫荧光及流式细胞仪检测PLK1野生型与Y425突变株细胞周期,发现Y425磷酸化影响细胞G2/M转换;3)激光共聚焦显微镜实时观察细胞,进一步确定c-ABL介导的PLK1 Y425磷酸化促进细胞进入有丝分裂。(三)c-ABL-PLK1轴影响CML化疗应答。1)Real-Time PCR及Western Blot检测临床CML患者外周血样本,发现BCR/ABL与PLK1在CML中高表达;与imatinib敏感患者相比,PLK1在imatinib抗性患者体内表达更高;2)imatinib有效降低临床患者CML中PLK1蛋白表达水平;3)K562细胞过表达PLK1抑制其对imatinib的化疗应答;4)c-ABL与PLK1抑制剂联合用药显著提高CML细胞的化疗应答;5)构建imatinib抗性CML小鼠模型,证实联合用药延长CML肿瘤模型小鼠存活时间。(四)c-ABL-PLK1轴影响宫颈癌肿瘤增殖及病人存活率。1)通过收集临床宫颈癌组织样本,发现c-ABL与PLK1在宫颈癌中高表达,同时在肿瘤组织中PLK1具有高度酪氨酸磷酸化修饰;2)裸鼠成瘤实验证明,PLK1 Y425位点突变抑制肿瘤增殖;3)临床随访数据证明,PLK1酪氨酸磷酸化与不良预后正相关;4)联合用药实验证明,c-ABL,PLK1抑制剂促进宫颈癌细胞的化疗应答。综上所述,我们的研究揭示了c-ABL-PLK1轴在有丝分裂进程及CML化疗应答中的重要功能。c-ABL通过直接磷酸化PLK1调控PLK1的蛋白稳定性和活性。过表达PLK1抑制了CML细胞对imatinib的化疗应答。同时imatinib与PLK1抑制剂的联合用药有助于imatinib抗性CML及宫颈癌细胞的治疗。我们的研究有望为imatinib抗性CML患者提供新的治疗靶标。此外由于PLK1的酪氨酸磷酸化与宫颈癌患者的不良预后相关,我们的研究同样为宫颈癌的诊断和治疗提供了新的线索。