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研究意义慢性创面是糖尿患者常见并发症,严重影响患者生活质量及生命安全。由于发病率高且复发率高,糖尿病创面修复给社会医疗资源及经济造成沉重负担。已成为糖尿病患者致死致残的主要原因。糖尿病下肢慢性溃疡截肢率高达25%,截肢后患者5年内死亡率高达50%。目前关于糖尿病创面愈合的机制仍不明确,且缺乏效果理想的治疗方法及药物。因此,对于糖尿病创面愈合机制的探索及新的药物靶点寻找依旧是临床面临的迫切需求。血管生成障碍是糖尿病创面难愈的重要原因,同时也是促进糖尿病创面愈合的重要靶标。内皮细胞功能紊乱是糖尿病的重要特征,与糖尿病血管并发症的发生发展密切相关。而其在创面愈合中的主要表现为血管内皮细胞应对缺氧及损伤刺激诱导的血管生成反应衰弱。氧化应激是糖尿病导致内皮细胞功能紊乱主要原因和中心环节。因此,从保护内皮细胞免受氧化应激损伤入手,挽救内皮细胞血管生成功能,是促进糖尿病创面愈合的有效途径之一。SIRT1是维持细胞稳态及抵抗环境应急的重要转录调节因子,在细胞DNA损伤修复、炎症反应、氧化应激及细胞凋亡等细胞功能的调控中发挥重要作用。大量研究表明,SIRT1通过参与上述细胞功能的调控对糖尿病及其并发症引起的组织损伤有保护作用,显示其在糖尿病及并发症的防治中有巨大潜能,但在糖尿病创面愈合过程中的作用仍不明确。因此,我们假设SIRT1可通过保护内皮细胞免于氧化应激损伤,增强创面血管生成能力从而促进糖尿病创面组织修复作用。研究目的探讨SIRT1对糖尿病创面血管内皮细胞功能的影响,进而揭示其参与糖尿病创面血管生成障碍的潜在机制,为糖尿病创面的修复探索新的药物靶点和理论依据。实验方法1.收集临床糖尿病患者创缘皮肤组织及急性创伤患者(无糖尿病史)创缘皮肤组织,利用qRT-PCR及Western Blot等常规分子生物学方法检测分析组织中SIRT1的表达特征,利用8-oxo-dG染色来评估创缘组织氧化应激损伤水平。2.构建STZ诱导的糖尿病小鼠创面模型,设立PBS治疗组及SRT1720(SIRT1特异性激动剂)治疗组,并另设以正常小鼠创面模型为对照,利用qRT-PCR及Western Blot等常规分子生物学方法检测SIRT1在糖尿病小鼠及正常小鼠完整皮肤和术后第7天创面组织中的表达水平,研究糖尿病对SIRT1在皮肤中表达水平的影响。分别在术后第1、3、7、14天观察比较正常小鼠创面模型组、STZ诱导的糖尿病小鼠创面模型组及STZ诱导各组小鼠创面模型+SRT1720治疗组之间愈合率的差异,探讨SIRT1对糖尿病创面愈合的影响。利用激光多普勒血流成像仪检测模型构建当天及术后第1、3、7天各组创面血流灌注的变化;收集糖尿病小鼠模型组及糖尿病模型+SRT1720治疗组小鼠术后第7天创面组织,利用CD34抗体染色评估小鼠创面血管生成状况;探讨SIRT1对糖尿病小鼠创面血管生成的影响。3.用HUVECs构建细胞模型,设立对照组(低糖培养)、高糖处理组(高糖培养)及高糖培养+SRT1720处理组。利用qRT-PCR及Western Blot等常规分子生物学方法检测SIRT1在高糖培养组及低糖培养组HUVECs中的表达水平;利用细胞划痕、Transwell细胞培养、Ki67免疫荧光染色及成管实验,观察SIRT1对高糖环境下HUVECs迁移、增殖及体外血管生成能力的影响;利用siRNA转染技术干扰HUVECs细胞SIRT1的表达,利用Transwell细胞培养实验、Ki67免疫荧光染色及成管实验来研究分析SIRT1对HUVECs迁移、增殖及体外血管生成能力的影响。4.用HUVECs构建细胞模型,设立对照组(低糖培养)、高糖处理组(高糖培养)及高糖培养+SRT1720处理组。利用ROS检测试剂盒检测各组细胞内ROS的产生水平,并检测细胞内重要抗氧化应激机制AKT/NRF2信号通路中关键分子的活性及表达水平,探索SIRT1对高糖条件下内皮细胞功能保护的可能机制。实验结果1.与急性创伤患者创缘组织比较,糖尿病创缘组织中SIRT1的mRNA及蛋白表达均明显降低(P<0.05,P<0.001);急性创伤患者创缘组织呈现较低水平的8-oxo-dG表达,而糖尿病创缘组织呈现出较高水平的8-oxo-dG表达。2.糖尿病小鼠模型组小鼠完整皮肤中SIRT1 mRNA及蛋白表达水平均低于正常小鼠组(P<0.001,P<0.01);糖尿病小鼠创面模型组中小鼠伤后第7天创面组织SIRT1 mRNA及蛋白表达均低于正常小鼠创面组(P<0.001,P<0.01)。创面愈合率评估结果显示:糖尿病小鼠创面组小鼠创面愈合率在伤后第3、7、14天均低于正常小鼠创面组(P<0.05,P<0.01,P<0.01);糖尿病小鼠创面+SRT1720治疗组小鼠创面愈合率在伤后第7天和14天均高于糖尿病小鼠创面组(P<0.01,P<0.01)。激光多普勒检测结果显示,糖尿病小鼠创面组小鼠创面血流灌注量在创面构建当天及伤后第1、3、7天均低于正常小鼠创面组(P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01),而糖尿病小鼠创面+SRT1720治疗组的小鼠创面血流灌注量在伤后第3天及第7天均高于糖尿病小鼠组(P<0.05,P<0.05)。CD34免疫组化染色结果显示糖尿病小鼠创面+SRT1720治疗组的小鼠伤后第7天创面血管密度显著大于糖尿病小鼠组(P<0.01),且创面新生血管排列规律,管腔宽畅。3.与低糖培养组比较,高糖培养组HUVECs内SIRT1 mRNA及蛋白表达均显著降低(P<0.01,P<0.001)。细胞划痕实验结果显示:高糖培养组HUVECs的划痕愈合率在各观测点(划痕后24h、48h及72h)均低于低糖培养组(P<0.01,P<0.01,P<0.01),而高糖培养+SRT1720组HUVECs的划痕愈合率在各观测点(划痕后24h、48h及72h)均高于高糖培养组(P<0.05,P<0.05,P<0.05)。Transwell细胞培养实验结果显示:高糖培养组HUVECs 24小时后的穿膜细胞数目明显低于低糖培养组(P<0.01);而高糖培养+SRT1720处理组的HUVECs 24小时后的穿膜细胞数目明显高于高糖培养组(P<0.01)。Ki67免疫荧光染色结果显示,高糖培养组HUVECs Ki67的表达水平明显低于低糖培养组(P<0.001);而高糖培养+SRT1720处理组的HUVEC Ki67的表达水平明显高于高糖培养组(P<0.001)。成管实验结果显示,高糖培养组HUVEC的管腔总长度及分支节点数目均明显低于低糖培养组(P<0.001,P<0.001);而高糖培养+SRT1720处理组的HUVEC管腔总长度及分支节点数目明显高于高糖培养组(P<0.01,P<0.01)。siRNA干扰实验结果显示:SIRT1干扰序列转染组HUVEC 24小时后的穿膜细胞数目、Ki67表达、管腔总长度及分支节点数目均低于无效序列转染组HUVEC(P<0.01,P<0.001,P<0.01,P<0.001)。4.高糖培养组HUVECs内ROS的产生水平明显高于低糖培养组细胞(P<0.01),而AKT磷酸化水平、NRF2及NQO1的表达水平均低于低糖培养组(P<0.05,P<0.001,P<0.001);高糖培养+SRT1720处理组HUVEC细胞内ROS的产生水平明显低于低糖培养组细胞(P<0.01),而AKT磷酸化水平、NRF2及NQO1的表达水平均高于高糖培养组(P<0.05,P<0.01,P<0.01)。研究结论1.该部分结果表明,在急性创伤组织低水平氧化应激是组织修复的需求,而糖尿病创面组织严重的氧化应激可能是破坏糖尿病创面愈合过程的原因之一;而SIRT1在糖尿病创面组织中表达受抑可能与其创面难以愈合相关。2.SIRT1激活可有效促进糖尿病小鼠创面愈合,该作用可能与其对创面血管生成的积极调控相关。3.SIRT1是HUVECs维持良好迁移、增殖及分化能力不可缺少的转录因子,高糖应激抑制HUVECs中SIRT1的表达是导致HUVECs迁移、增殖及分化能力受损的机制之一,SIRT1激活可有效改善高糖应激条件下受损的内皮细胞功能。4.高糖诱导HUVECs内ROS产生增多,可能与抑制AKT磷酸化,降低NRF2及其下游基因NQO1表达相关,而SIRT1激活可能通过增强AKT磷酸化,上调NRF2及NQO1的表达,抑制高糖培养条件下内皮细胞内ROS的过量产生。