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在目前已知序列的六种卤醇脱卤酶中,根据它们的氨基酸序列相似性把它们分为A,B和C三种。其中来源于放射性土壤杆菌的卤醇脱卤酶HheC已被深入研究,而对于A类和B类的了解甚少。鉴于HheA和HheC底物特异性和立体选择性上的不同,对HheA的改造以扩大其底物范围或增强立体选择性,都可以使其在环境、医药、工业和农业中发挥很好的应用。因此,本文主要从以下三方面展开工作: 首先,酶的体外高效表达和纯化是开展上述研究的基础,而 HheA体外重组表达水平仅为HheC的三分之一,本文在系统分析影响卤醇脱卤酶HheA表达的因素后,确定了N端+2位点密码子优化方法,使卤醇脱卤酶HheA的表达量较野生态提高了4倍,在此基础上简化了纯化步骤,纯化后得率为野生态的8倍。 第二,研究发现,利用卤醇脱卤酶生产β-羟基氰,β-硝基醇等具有光学纯β取代产物是卤醇脱卤酶的重要应用之一,但目前实验室还缺乏一个有效的卤醇脱卤酶催化环氧化物开环反应筛选方法。实验通过反应时间梯度和高碘酸钠浓度梯度实验,成功地将肾上腺素方法应用于卤醇脱卤酶催化环氧化物开环反应的筛选,并且发现卤醇脱卤酶催化环氧化物开环具有亲核试剂选择性,该方法也可以用以筛选对特定亲核试剂偏好的突变体。 最后,在以上基础上,通过构建随机突变文库对 HheA进行定向改造,使用已有的脱卤筛选方法和本文构建的开环反应筛选方法对突变文库进行筛选,获得的突变体通过DNA重组进一步进行筛选,利用氯离子测定和气相色谱检测获得突变体的催化活性和立体选择性。