背景与目:的胞膜窖(caveolae)是50～100nm烧瓶状的细胞膜结构，和信号传导密切相关。窖蛋白-1(caveolin-1)是胞膜窖的主要结构成分，在细胞内吞、胆固醇运输、信号传导、肿瘤转化中发挥着重要的作用。 研究表明，几乎所有正常细胞均有caveolin-1的表达，而在大多数肿瘤细胞如乳腺癌细胞和肺癌细胞中，caveolin-1表达下降或无表达，重新表达caveolin-1会抑制肿瘤细胞生长及肿瘤细胞集落的形成，反义核酸抑制caveolin-1表达则会增强细胞转化能力，提示caveolin-1可能具有抑瘤作用，因此caveolin-1基因被许多学者认为是候选的抑癌基因。然而近年研究表明，在前列腺癌细胞和膀胱癌细胞中caveolin-1高表达，而且表达水平与前列腺癌细胞和膀胱癌细胞细胞淋巴道转移潜能呈正相关；通过RNAi下调caveolin-1的表达能够抑制肿瘤细胞的生长、转化及转移能力，因此caveolin-1还被认为是淋巴道转移相关基因。所以，深入研究caveolin-1在不同肿瘤细胞中的作用有重要的意义。 目前，有关caveolin-1和肝癌转移方面的报道很少。本课题组前期工作表明，在HCa-F(高淋巴道转移株)中caveolin-1表达量高于HCa-P(低淋巴道转移株)和Hepa1-6(无淋巴道转移)，在Hepa1-6细胞中没有检测到caveolin-1的表达，提示caveolin-1在小鼠肝癌细胞淋巴道转移中发挥作用。 本文旨在通过克隆小鼠caveolin-1cDNA、构建其表达载体并将其稳定表达于小鼠肝癌细胞Hepa1-6中，观察Hepa1-6细胞生物学的变化，为进一步研究caveolin-1在小鼠肝癌细胞淋巴道转移中发挥作用提供实验基础。 方法: 1.从小鼠肺组织中提取总RNA，利用caveolin-1特异性引物经RT-PCR扩增caveolin-1cDNA24-557bp片段，克隆至PMD18-Tsimplevector，然后亚克隆到真核表达载体质粒pEGFP-N2上，经转化、抗生素初步筛选、限制性核酸内切酶酶切和DNA测序获得重组质粒pEGFP-N2/Cav1。 2.利用脂质体将重组质粒pEGFP-N2/Cav1转染至小鼠肝癌细胞Hepa1-6上，空载体做对照，经G418筛选及RT-PCR和Westernblot分析，获得稳定表达株。 3.MTT法检测caveolin-1对Hepa1-6细胞生长和增殖的影响，并利用软琼脂克隆形成实验观察细胞生物学性状的变化。 结果: 1.利用RT-PCR从小鼠肺组织总RNA中成功克隆出546bp的caveolin-1cDNA的24-557bp片断，重组阳性克隆经酶切和测序鉴定证实目的基因已正确插入pEGFP-N2表达载体中，且与载体上的GFP基因处于同一开放阅读框，记为pEGFP-N2/Cav1。 2.利用脂质体转染技术，G418筛选获得4个稳定表达外源caveolin-1的Hepa1-6细胞株，记为Hepa1-6/Cav1。并经RT-PCR、Westernblot方法证实外源caveolin-1基因整合到Hepa1-6细胞基因组中。免疫细胞化学和电镜结果表明，caveolin-1在Hepa1-6细胞胞膜和胞浆中均有表达。 3.与转染空载体组细胞(Hepa1-6/mock)和未转染组细胞Hepa1-6比较，Hepa1-6/Cav1组细胞增殖无明显改变(P＞0.01)；但在软琼脂中的集落形成数明显增加(P＜0.01)。 结论: 1.构建了小鼠caveolin-1cDNA(24-556bp)的克隆载体T-Cav1和真核表达载体pEGFP-N2/Cav1。 2.转染pEGFP-N2/Cav1使caveolin-1在小鼠肝癌细胞Hepa1-6中稳定表达，且主要表达在Hepa1-6细胞的胞膜上。 3.外源caveolin-1在小鼠肝癌细胞Hepa1-6中的表达可能会提高该细胞的转化能力。