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[目的]miR-146b-5p是胶质瘤的抑癌miRNA (Tumour suppressing miRNA, TS-miRNA)。浸润性生长是胶质瘤的突出特征,也是导致其手术不易全切、术后复发率高及预后不良的主要原因。已知基质金属蛋白酶16(Martrix metalloproteinase16, MMP16)过表达与多种颅外恶性肿瘤的浸润性生长密切相关。生物信息学预测提示MMP16可能是miR-146b-5p的天然靶基因。然而,不同级别胶质瘤细胞中miR-146b-5p及MMP16的表达有无差异,二者表达变化的相互关系及其在胶质瘤发生、发展中有何作用,：miR-146b-5p对胶质瘤细胞侵袭、迁移和凋亡有何影响及其分子机制,均尚不清楚。本研究旨在对上述问题进行深入系统的探讨。[研究方法](1)利用锁定寡核苷酸探针原位杂交和免疫组织化学方法分别检测了10例人非肿瘤对照脑组织和60例不同级别胶质瘤组织中miR-146b-5p和MMP16的表达状况。(2)采用荧光素酶实验、qRT-PCR及Western blot验证MMP16是否是miR-146b-5p的靶基因,进一步研究miR-146b-5p下调MMP16表达的机制。(3)经表达质粒转染和G418筛选建立稳定过表达miR-146b-5p的人胶质母细胞瘤细胞系(U87MG. SNB19. TJ905)的亚细胞系及它们的对照亚细胞系,采用stem-loop qRT-PCR.普通qRT-PCR和Western blot分别检测各亚细胞系miR-146b-5p. MMP16mRNA和MMP16蛋白的表达水平。(4)采用Western blot和明胶酶谱检测验证上调miR-146b-5p表达是否能抑制MMP16的表达和阻断MMP2酶原激活。(5)利用体外侵袭迁移实验和Matrigel3D培养来比较miR-146b-5p过表达亚细胞系和相应对照亚细胞系的侵袭迁移能力；用靶向MMP16的特异性siRNA阻断MMP16表达,进一步验证miR-146b-5p是否是通过下调MMP16表达抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭。(6)通过流式细胞术(FCM)和碱性单细胞电泳实验(SCGE)来评价各亚细胞系的细胞凋亡水平。(7)通过流式细胞术(FCM)检测各亚细胞系细胞周期分布情况。[研究结果](1)原位杂交结果显示,WHO Ⅰ～Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤组的miR-146b-5p阳性标记指数(LI%)分别为13.34±0.14、8.60+0.17、2.90±1.26,并均明显低于非肿瘤对照脑组织的LI%(34.23±1.58,P<0.0001)；miR-146b-5p表达水平随着胶质瘤良恶性级别的升高相应降低,除Ⅰ-Ⅱ级组与Ⅲ级组外,其余各组之间的差异均有统计学意义(P<0.001)。而MMP16表达水平则呈相反趋势,对照脑组织的MMP16LI%最低(0.40-±0.55),且其表达水平随胶质瘤良恶性级别增加相应升高(WHO Ⅰ-Ⅱ级、Ⅳ级利Ⅳ级组分别为25.99±1.24、30.99±1.30、64.37±6.26)；除Ⅰ～Ⅱ组与Ⅲ组之间外,其余各组间的差异均有统计学意义(P<0.0001)。经直线相关分析证实,以上两种指标之间呈显著性负相关(r=-0.634,P<0.0001)。(2)荧光素酶实验结果显示,在胶质瘤细胞里,miR-146b-5p可通过与野生型MMP16mRNA的3’UTR特异性结合,介导其对荧光素酶报导基因表达的沉默作用；因miR-146b-5p不能与突变型MMP16mRNA的3’UTR结合,当用二者共转染胶质瘤细胞时不能沉默荧光素酶报导基因的表达；从而证实MMP16是miR-146b-5p的天然靶基因。(3)与相应的对照亚细胞系相比,miR-146b-5p过表达亚细胞系的miR-146b-5p表达水平明显升高,而MMP16mRNA及蛋白表达水平均明显降低,说明miR-146b-5p可以通过直接降解MMP16mRNA阻断MMP16表达。(4)miR-146b-5p不影响pro-MMP2的表达,而是通过抑制MMP16的表达阻断细胞外pro-MMP2的激活过程。(5)过表达1niR-146b-5p可通过上述机制有效的抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭,而MMP16特异性小干扰RNA可以部分的模拟miR-146b-5p对胶质瘤细胞迁移和侵袭的抑制作用,表明miR-146b-5p/MMP16/MMP2通路在miR-146b-5p介导的胶质瘤细胞迁移和侵袭抑制效应中发挥重要作用。(6)流式细胞术及碱性单细胞电泳实验结果显示,miR-146b-5p过表达亚细胞系的凋亡指数(AI%)明显高于对照亚细胞系,但是细胞周期分布无明显改变,提示miR-146b-5p可诱导胶质瘤细胞凋亡而不抑制其增殖。[结论](1)随着胶质瘤恶性度的升高,miR-146b-5p表达水平降低,而MMP16表达水平增加,二者呈显著负相关,miR-146b-5p和MMP16表达水平可作为评价胶质瘤生物学行为及患者预后的重要参考指标。(2)本研究建立的]miR-146b-5p过表达亚细胞系可稳定高表达miR-146b-5p,是研究miR-146b-5p抑瘤效应的理想细胞模型。(3)在胶质瘤细胞中,MMP16是miR-146b-5p的天然靶基因,miR-146b-5p通过直接降解其mRNA来下调MMP16蛋白表达。(4) miR-146b-5p不影响pro-MMP2的表达,而是通过抑制MMP16的表达阻断细胞外pro-MMP2激活过程,进而有效的抑制胶质瘤细胞侵袭。(5) miR-146b-5p对胶质瘤细胞的增殖和细胞周期分布无影响；但可显著抑制胶质瘤细胞的迁移和诱导其凋亡,但后两种调控作用的分子机制尚不清楚,还有待于进一步探讨。(6) miR-146b-5p表达异常减少是导致胶质瘤发生、发展的重要因素,补充外源性miR-146b-5p可逆转上述异常并发挥有效的抑瘤作用,故其作为一种多功能抑瘤因子,在恶性胶质瘤基因治疗方面有重要的实用价值。