化石燃料燃烧产生的CO2持续不断地释放到大气中,其中约有1/4～1/3会被海洋吸收,从而导致表层海水pH下降,造成所谓的海洋酸化,对海洋系统造成严重影响。有报道指出海洋酸化胁迫会影响海洋钙质生物的生长发育、基因表达和代谢过程,但关于海洋酸化对鲍基因表达及代谢过程影响的研究还较少。另外,有许多研究指出环境胁迫会改变生物的DNA甲基化状态,从而影响生物的基因表达,调节生物在胁迫环境中的生存与发育状态,但在海洋钙质生物中相关的研究有限。本实验通过模拟未来的海洋环境(对照组:400ppm、中度酸化组:800ppm和高度酸化组:1500ppm),研究短时间和长时间酸化胁迫对皱纹盘鲍(Haliotis discus hani)和杂色鲍(Haliotis diversicolor)生长发育及存活的影响,并从DNA甲基化、基因表达和代谢组层面探究了酸化胁迫对鲍分子功能的影响。主要研究结果如下:1.海洋酸化胁迫对皱纹盘鲍和杂色鲍成体生长存活的影响短时间(胁迫时长2W以内)中度酸化胁迫能促进皱纹盘鲍和杂色鲍的生长,而短时间高度酸化胁迫只促进皱纹盘鲍的生长却抑制杂色鲍的生长;长时间(胁迫时长达4M级以上)中度和高度酸化胁迫都会抑制皱纹盘鲍和杂色鲍的生长。短时间酸化胁迫不会导致皱纹盘鲍的死亡,但会使杂色鲍的死亡率明显增加;长时间高度酸化胁迫会使皱纹盘鲍的成体死亡率明显增加,而中度酸化胁不影响皱纹盘鲍的存活;但长时间中度和高度酸化胁迫都会导致杂色鲍的死亡率明显增加。2.皱纹盘鲍亲本经长时间(10.5M)酸化胁迫对其幼体发育的影响在比较酸化水体与正常水体中幼体发育情况时发现:(1)就受精率和畸形率而言,不论亲本是否提前经酸化胁迫处理,高度酸化胁迫会导致皱纹盘鲍的受精率降低和畸形率升高。(2)就孵化率而言,父母本均未提前经酸化胁迫处理时,酸化胁迫会降低皱纹盘鲍的幼体孵化率;但父母本中有一方提前经酸化胁迫处理时,酸化胁迫组的孵化率会升高。(3)就死亡率和面盘幼体的壳长而言,在母本未经酸化胁迫处理而父本提前经长时间酸化胁迫处理时,酸化胁迫会降低幼体死亡率、增加壳长,即有利于幼体在酸化环境中的生存与生长;但当母本经长时间酸化胁迫处理时,父本提前经酸化胁迫处理形成的有利作用会消失。比较亲本未经与提前经酸化胁迫时的幼体发育情况发现:(1)就受精率而言,与亲本未经酸化胁迫时相比,亲本经长时间高度酸化胁可提高受精率,而亲本经长时间中度酸化胁迫会降低受精率。(2)就孵化率而言,在母(父)本未经酸化胁迫时,父(母)本提前经长时间酸化胁迫处理会提高酸化水体中的幼体孵化率(与父(母)本未经酸化时相比),但正常水体中相反。(3)就畸形率、死亡率和面盘幼体壳长而言,在母本未经酸化胁迫时:父本提前经酸化胁迫处理会使皱纹盘鲍在酸化水体中的幼体畸形率和死亡率降低、面盘幼体壳长增加(与父本未经酸化胁迫时相比),但正常水体中的情况相反;当母本也提前经酸化胁迫处理时:父本经提前酸化胁迫处理形成的胁迫环境中的生长、发育优势会减弱。另外,不论父本是否提前经酸化胁迫处理,母本提前经酸化胁迫处理会使正常水体和酸化水体中的幼体畸形率和死亡率升高、面盘幼体壳长降低(与母本未经酸化胁迫时相比)。3.海洋酸化胁迫对皱纹盘鲍和杂色鲍外套膜DNA甲基化的影响皱纹盘鲍和杂色鲍的外套膜DNA总甲基化率分别在22.76%～32.46%和50.32%～57.72%的范围内,其中外部半甲基化率分别在3.40%～7.96%和12.37%～21.06%的范围内,内部全甲基化率分别在18.40%～24.52%和34.22%～41.83%的范围内。皱纹盘鲍外套膜DNA的总甲基化率、外部半甲基化率和内部全甲基化率都低于杂色鲍,但两者均表现出内部全甲基化率(CG型)高于外部半甲基化率(CHG型)的情况。皱纹盘鲍在胁迫24h、1W和1Y时,酸化组和对照组之间的总甲基化率无显著差异,但都表现出酸化组低于对照组的趋势:在胁迫3M时,高度酸化组的DNA总甲基化率显著低于对照组和中度酸化组,而中度酸化组与对照组之间无显著差异,而且这种显著差异是由内部全甲基化率的显著降低引起的。但杂色鲍在所有已测的胁迫时间点内,酸化组和对照组之间的总甲基化率均无显著差异,但表现出酸化组高于对照组的趋势。4.海洋酸化胁迫对皱纹盘鲍壳形成相关基因表达的影响本实验共分析了 11个壳形成相关基因的表达情况,其中HasSom、TYR和PRX可促进角质层着色,HasSom在短时间酸化胁迫时表达显著增加,而TYR和PRX在长时间酸化胁迫时出现表达量升高的趋势(未达到显著升高水平)。EPP基因具有协助HasSom参与角质层着色的功能,在酸化胁迫未达1Y时表现出对HasSom基因的补偿作用,但胁迫达1Y时补偿作用消失。CaM基因在短时间酸化胁迫时显著降低表达,表现出对钙化过程的补偿作用;而在长时间胁迫时表现出表达升高的趋势,可促进角质层修复,但胁迫达1Y时修复作用消失。CA基因在高度酸化胁迫条件下表现出表达降低的趋势,有助于缓解鲍体内pH降低,对钙化有利。NACR基因具有壳修复的功能,酸化胁迫具有增强其表达的趋势,且在中度酸化胁迫条件下能更快速明显地发挥修复作用。CHI和Pif177基因具有缓解酸化胁迫对珍珠层损伤的作用,其中CHI仅在中度酸化胁迫时发挥缓解作用;Pif177基因在短时间胁迫时发挥较强的缓解作用,随胁迫时间延长作用减弱。PLUC和PLUS基因具有促进文石晶体沉淀的作用,可发挥珍珠层修复作用,其中PLUC在长时间酸化胁迫时更能发挥修复作用;PLUS在中度酸化胁迫时,短时间内可发挥修复作用,而在高度酸化胁迫时,需经长时间胁迫才能发挥修复作用。5.长时间海洋酸化胁迫对皱纹盘鲍影响的代谢组学分析通过OPLS-DA和聚类分析发现对照组和高度酸化组样品可以明显区分,GC-MS分析检测出628个代谢物,经数据过滤筛选保留549个注释代谢物。最终筛选出10个显著差异代谢物,均为高度酸化组上调表达,其中果糖-2、苏糖酸和4-羟基苯乙酸的含量是对照组的2万倍以上。通过代谢通路分析发现生物素、6-磷酸葡萄糖-1、α-氨基乙二酸和苏糖酸与能量代谢相关;果糖-2与蛋白质和核酸合成相关;吲哚-3-乙酸和4-羟基苯乙酸与角质层色素合成相关,表明酸化胁迫会影响皱纹盘鲍的能量代谢、蛋白和核酸合成及壳角质层着色过程。上述结果表明生物素、6-磷酸葡萄糖-1、α-氨基乙二酸、果糖-2、苏糖酸、吲哚-3-乙酸和4-羟基苯乙酸具有成为皱纹盘鲍酸化胁迫检测的生物标记物的潜力。