目的 因为肝脏容量小造成的小肝综合症在某种程度上限制了活体肝移植及劈裂式肝移植的应用。如何找到新的药物治疗策略以解决这种边缘性供体的再灌注损伤将具有重要的临床意义。 鉴于目前关于Akt细胞生存通路的研究提示Akt的活化具有重要的生理学意义，其不仅可以通过抑制凋亡促进细胞生存，而且可以通过促进eNOS的活性，扩张血管。小肝综合症的发生机制不仅与小肝容积过小造成的短暂的门脉压力引起肝窦收缩有关，而且与调节细胞凋亡基因的增加有关。因此通过在损伤早期采用促进Akt活化的药物治疗策略，有可能减轻小肝移植后的缺血再灌注损伤，对扩大供体肝脏的应用有着重要的临床意义。 本实验采用大鼠原位小肝移植模型，探讨FTY720对小肝移植肝移植冷缺血再灌注损伤是否具有保护作用，并在此基础上研究FTY720对小肝移植冷缺血再灌注损伤保护作用的机制，为临床用药提供实验依据。 方法 为建立大鼠原位小肝移植冷缺血再灌注损伤模型，本实验在采用改良Kamada法的基础上，就建立稳定的大鼠原位正常小肝及脂肪变小肝移植冷缺血再灌注损伤模型的具体方法进行探讨。 雄性纯种Lewis大鼠分别作为供体及受体，将实验动物随机分为两组，对照组22只，FTY720治疗组18只。建立无静脉-静脉旁路的原位大鼠小肝移植模型，供体肝脏切取肝叶，使供体肝重量约占受体肝脏重量的36-45％，平均39％。对FTY720治疗组，1mg／kg体重的FTY溶于1ml生理盐水内，分三次分别在供体肝脏取出前20min，受体肝脏取出前及灌注开始后各给予1祖。在同样的时间点给对照组注射相同数量的生理盐水。 采用生化分析对肝功能进行定量，HE及电镜检查细胞形态学改变，TUNEL法检测细胞凋亡情况，Westem一hlot检测细胞内Akt细胞生存通路，CasPases调往通路及MAPK炎症反应通路。免疫组织化学法检测细胞内phospho一Akt，AZo，eNOS及iNOS的表达情况。结果 月叮720对大鼠原位小肝移植冷缺血再灌注损伤的保护作用:为探讨们叮720对大鼠原位小肝移植肝脏冷缺血再灌注损伤的保护作用，本实验分别检测移植术后6、24小时血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)含量，并观察移植术后一周存活率。与对照组比较，治疗组术后肝功能及一周存活率明显改善，肝细胞损伤明显减轻。因此，FTY720对大鼠原位小肝移植肝脏冷缺血再灌注损伤具有保护作用。 们叮720减少细胞凋亡，保护肝细胞结构:光镜检查:灌注后6及24小时标本HE染色显示们万720较好的保护肝细胞的显微结构，肝小叶结构基本正常，肝细胞轻度空泡变性，汇管区炎性细胞浸润少，肝窦扩张，肝窦内皮细胞扁平，基本完整。相反对照组灌注后6小时标本HE染色显示肝小叶结构紊乱，肝细胞肿胀，空泡变性，肝窦内皮细胞受损肿胀，内皮细胞脱落，可伴有斑片状坏死。 电镜检查:电镜下肝细胞超微结构显示与对照组相比们刃720治疗组灌注后6小时及24小时肝脏结构基本正常，对照组灌注后6小时肝细胞结构破坏。 肝组织TUNEL检测:灌注后6及24小时月万720治疗组凋亡的肝细胞及肝窦内皮细胞明显减少，其Al均值显著降低;而对照组再灌注后6小时及24小时可见显著增多散在的肝实质细胞及肝窦内皮细胞凋亡。 曰刃720通过Akt磷酸化激活细胞生存通路:我们采用westem印迹法检测磷酸化Akt细胞生存通路的蛋白表达情况。本实验发现们万720对Akt有磷酸活化作用。在移植灌注后24小时，PrY72O显著上调磷酸化Akt表达，其Akt的磷酸化主要在473位点。伴随着Akt473的活化，Akt的三个下游底物Bad，GSK及FKHR也相应的被磷酸化而失活，灌注后24小时我们检测到磷酸化Bad，GSK及FKHR蛋白表达显著上调。应用免疫组织化学检测，发现在灌注后6及24小时，与对照组相比，n，Y 720显著上调细胞内磷酸化Aki的表达，并且磷酸化Aki的表达主要在肝细胞及肝窦内皮细胞。 们万720上调抗凋亡基因，下调促凋亡基因的表达协20是一种锌指蛋白，A20的过度表达可以抑制多种因素介导的凋亡。本试验Westem印迹法发现与对照组相比灌注后24小时们万720显著上调AZO的蛋白表达水平。免疫组织化学检测也同样显示们万720可以显著上调细胞内A20基因的蛋白表达，AZO的表达主要表现在肝细胞及肝窦内皮细胞。而在对照组中，则检测到较低水平的AZO表达。另一方面，Westem印迹法检测发现门万720显著下调分裂形式的Caspases3，7及9的蛋白表达水平。与Akt磷酸化表达抑制细胞凋亡的趋势相一致，deaved CasPases3，7及9的蛋白表达水平在移植后24小时的时间点上显著低于对照组。 们万720下调MAPK通路:MAPKs通路对肝脏缺血再灌注急性期炎症损伤有重要作用。本实验中应用Weste。印迹法检测到，与对照组相比再灌注后6及24小时们T720显著下调MAPKs通路中磷酸化raf，MEK及Erk的蛋白表达水平。伴随着炎症通路的下调，相应的免疫组织化学检测显示与对照组相比月万720可以显著降低灌注后6及24小时组织炎症细胞因子iNOS的细胞内表达水平。 叮Y72O上调细胞内eN