第一部分:构建及鉴定继发性TRAIL耐药细胞株目的:构建TRAIL继发性耐药肺癌细胞株H460-TR,比较敏感细胞株和继发性耐药细胞株的TRAIL敏感性差异,探讨TRAIL继发性耐药的分子机制。方法:通过低浓度逐渐诱导至高浓度杀伤H460敏感细胞,构建继发性TRAIL耐药的非小细胞肺癌H460-TR。通过CCK-8法和流式检测细胞凋亡,探讨敏感株与继发耐药株的TRAIL敏感性差异。通过western blot检测外源性凋亡和内源性凋亡信号通路上相关蛋白的表达情况。通过荧光定量qRT-PCR和western blot检测H460和H460-TR细胞中死亡受体的表达情况。使用间接免疫荧光染色法,流式细胞术检测细胞膜表面死亡受体的表达情况。提取敏感株与耐药株细胞膜蛋白,检测TRAIL诱导下,H460和H460-TR细胞膜死亡受体的表达水平。结果:通过光学显微镜观察发现,敏感细胞株与继发耐药细胞株在形态学上无明显变化。但在给予TRAIL诱导处理后,敏感株发生细胞死亡现象更明显。通过CCK-8法检测敏感细胞株与继发耐药细胞株的TRAIL药物毒性发现,随着剂量的增加,H460细胞存活率更少,而H460-TR则表现相对耐药。同样,在流式检测细胞凋亡试验中,给予相同剂量的TRAIL处理相同时间,H460发生凋亡率明显较H460-TR更高。说明继发性耐药细胞株H460-TR构建成功。检测死亡诱导信号复合体（DISC）中相关蛋白表达无明显差异,但耐药细胞株中凋亡拮抗因子cFLIP表达增加。检测内源性凋亡通路相关信号分子显示,抗凋亡分子Mcl-l在耐药细胞株中表达增加。检测亲本与耐药株之间死亡受体、诱骗受体基因及蛋白表达水平均未见明显差异。当给予TRAIL诱导后,H460细胞膜表面的死亡受体表达逐渐升高,而继发性耐药的H460-TR细胞中,细胞膜表面受体变化不明显。结论:成功构建TRAIL继发性耐药细胞模型H460-TR。在外源性凋亡和内源性凋亡信号通路中,凋亡拮抗因子cFLIP和抗凋亡分子Mcl-l的表达升高。对比敏感株和耐药株,经TRAIL诱导后的细胞膜表面死亡受体水平,才是影响TRAIL获得性耐药的最关键因素。第二部分:TRAIL原发性耐药株、继发性耐药株及敏感株mRNA表达谱研究目的:探讨非小细胞肺癌TRAIL敏感株、原发性耐药株以及继发性耐药细胞株全基因表达谱差异。方法:选取非小细胞肺癌TRAIIL敏感株H460、原发性耐药株A549以及继发性耐药细胞株H460-TR,使用全基因表达谱芯片筛选TRAIL药物敏感性差异表达基因,并对其进行数据差异分析。结果:分别提取TRAIL原发敏感的H460细胞系,TRAIL原发耐药的A549细胞系以及TRAIL诱导耐药的H460-TR细胞系的mRNA,反转录成cDNA同时进行标记。将芯片扫描得到的原始数据进行归一化处理后,采用Fold-change（表达差异倍数）以及T检验得到差异基因的数据集。最终筛选得到A549细胞与H460细胞间差异表达基因5047个,而H460-TR细胞与H460细胞间差异表达基因1338个。对差异基因进行GO富集分析,结合KEGG网站对筛选出的差异基因和生物途径分析,并绘制KEGG路径图。其中KEGG信号通路富集结果包括A549细胞与H460细胞间差异表达基因和H460-TR细胞与H460细胞间差异表达基因。结论:不管是原发耐药和诱导继发耐药过程中,均涉及到多靶点、多基因的改变。对相关基因功能、涉及的信号通路进一步深入分析,将有可能阐释TRAIL耐药的确切分子机制,为靶向药物治疗耐药提供新的靶点和思路,也为阐明临床应用过程中,出现TRAIL耐药的具体分子机制提供新的研究视角。第三部分:TRKA磷酸化β-catenin调控细胞TRAIL敏感性的相关研究目的:探讨β-catenin在继发性TRAIL耐药细胞株中的表达变化,并分析β-catenin表达变化对敏感株及耐药株TRAIL药物敏感性的影响。通过检测死亡受体DR4/5的膜蛋白水平,说明β-catenin调控细胞TRAIL敏感性的作用及机制;初步探讨通过β-catenin逆转TRAIL耐药的相关机制。方法:通过基因芯片数据,筛选出与β-catenin存在相互作用的差异基因。采用实时荧光定量PCR验证芯片的筛选结果。通过TRKA的特异性小分子抑制剂,验证TRKA调控β-catenin影响耐药细胞TRAIL敏感性的相关性。qRT-PCR及Western blot检测敏感株H460及耐药株H460-TR细胞中β-catenin的表达水平。构建β-catenin基因沉默慢病毒系统以及转染过表达质粒至H460/H460-TR细胞中,使用qRT-PCR及Western blot验证基因的沉默或过表达效率。通过CCK-8法与流式细胞术检测β-catenin沉默或过表达后的TRAIL药物敏感性的变化。检测凋亡下游信号通路效应蛋白caspase的表达情况。通过检测β-catenin沉默或过表达后死亡受体的基因及蛋白水平,以及膜蛋白表达水平的变化,验证β-catenin通过影响死亡受体在细胞膜上的表达情况进而影响细胞TRAIL药物敏感性的差异。结果:通过分析与β-catenin相互作用的基因并进行荧光定量PCR验证,我们发现H460-TR中TRKA呈高表达状态。通过使用TRKA激酶小分子抑制剂联合TRAIL作用于继发性耐药H460-TR细胞,能够增加继发性TRAIL耐药的药物敏感性。TRKA特异性小分子抑制剂能抑制β-catenin磷酸化的发生,促进β-catenin总蛋白表达增加。β-catenin的mRNA及蛋白表达在继发性耐药株H460-TR中较敏感株H460明显降低。转染沉默或过表达β-catenin的质粒至Hela细胞中,经基因和蛋白水平验证有效。进一步采用sh-RNA靶序列,构建β-catenin基因沉默慢病毒系统,鉴定病毒系统有效。采用CCK-8和流式细胞术检测凋亡结果可知,当β-catenin沉默后,H460细胞的TRAIL敏感性下降,细胞表现为耐药作用;反之,当过表达β-catenin后,耐药株H460-TR的TRAIL敏感性增加。检测凋亡相关蛋白表达量结果表明:当β-catenin沉默或过表达后,TRAIL能降低或促进caspase家族的活化作用,进而影响TRAIL的药物敏感性。在β-catenin基因沉默或者过表达后,qRT-PCR及western blot检测死亡受体的基因及蛋白水平呈正相关性改变。尤其是在给予TRAIL药物诱导之后,死亡受体在细胞膜上的表达与β-catenin表达改变呈同向变化。结论:通过使用TRKA激酶小分子抑制剂联合TRAIL作用于继发耐药的H460-TR细胞,能够逆转继发性TRAIL耐药的药物敏感性。TRKA能够通过磷酸化β-catenin,使其从细胞膜上解离进入细胞质内,进而发生降解。继发性耐药细胞的发生与β-catenin的表达下降相关。当在继发性耐药细胞H460-TR中过表达β-catenin,能够增加细胞对TRAIL的药物敏感性。通过β-catenin的沉默或过表达研究发现,过表达β-catenin能够上调耐药株细胞膜表面的死亡受体表达量,使死亡受体在细胞膜表面的聚集增多,进而激活下游caspase家族活性,促进TRAIL诱导凋亡效应增强。