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Bacillus amyloliquefaciens LL3是一株谷氨酸非依赖型的γ-聚谷氨酸(γ-PGA)合成菌，还具有合成多种其他次级代谢产物的潜力。本研究采用upp作为反向筛选标记并结合温度敏感型质粒pKSV7构建了能够在LL3中完成无痕基因敲除的方法。构建upp缺失菌株作为敲除实验的初始菌株。pKSV7用来在42℃下获得单交换菌株，5-氟尿嘧啶用来筛选双交换菌株，并借助PCR和DNA测序验证发生正确敲除的菌株。Alpha-淀粉酶编码基因amyA和47kb的bacillaene编码基因簇（部分）等基因和片段的成功敲除，证明该方法可以有效地应用于LL3的遗传操作中。 利用所构建的方法开展了基因组精简和γ-PGA产量提高的分子改造。Surfactin, iturin，fengycin和bacillaene四种抗菌物质编码基因簇可能与γ-PGA竞争相同的底物和辅助因子等。四个基因簇的单独敲除对γ-PGA合成和菌体生长无显著影响，但surfactin,iturin，fengycin的敲除有效降低了发酵液的粘度。Surfactin的敲除降低了细菌swarming能力，而iturin和fengycin的缺失对生物被膜的形成产生了影响。四种物质同时敲除后，发酵液粘度降低，γ-PGA产量提高了34.5％。 对rocR,rocG，gudB和odhA四个与谷氨酸代谢相关基因进行了敲除，试图通过促进胞内谷氨酸合成来提高γ-PGA的产量。摇瓶实验中rocG/gudB双敲除菌株的γ-PGA产量提高了38.2%，而odhA的缺失影响了菌体的生长但γ-PGA产率提高接近两倍；在5-L发酵罐中，rocR突变株产量较野生型增加了42.9%，这体现出通过遗传改造谷氨酸代谢通路可以提高γ-PGA产量。 针对LL3衍生菌株感受态制作和转化出现的问题，本研究还对感受态制作流程进行了优化，对菌株的限制修饰系统进行了敲除。通过使用生长早期细胞（OD600<0.3）能够缓解菌体离心问题。对Bam HI限制修饰系统的敲除简化了转化流程，提高了转化成功率。 在LL3的基因组精简工作中，本研究共敲除了170kb的片段，约占整个基因组的4.35%。