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本研究在细胞水平探讨了let-7c及TRB2基因在肺腺癌发病中的作用。通过构建miR-99、let-7c表达载体和针对TRB2基因的RNAi载体,开展TRB2基因及相关miRNA在肺腺癌发病中的作用研究,为肺腺癌的临床治疗提供理论依据。一、niRNA对TRB2基因调控作用研究(一)pcDNA-GFP-TRB2-3’UTR载体构建：特异性扩增TRB2基因3’UTR序列,将其克隆至pcDNA-GFP载体中,鉴定结果显示成功构建pcDNA-GFP-TRB2-3’UTR载体。(二)miRNA对TRB2-3’的调控作用：将pcDNA-GFP-TRB2-3’UTR载体和miR-99及let-7c共转染A549细胞,共转染pcDNA-GFP-TRB2-3’UTR载体和NC作为实验对照。48h后,荧光显微镜下观察,与对照组相比,共转染组绿色荧光蛋白的表达量明显降低,共转染组TRB2基因的表达量降低,结果示：miR-99及let-7c能调控TRB2基因的表达,其中let-7c的调控作用更为有效。二、miR-99及let-7c对肿瘤细胞生长的抑制作用研究(一)miRNA表达载体的构建：PCR扩增获得目的miRNA (miR-99、et-7c)基因,将其连入T载体,然后通过事先设计的酶切位点将其连入pRNAi-U6.1/Neo载体中,获得pRNAi-U6.1/Neo-miR-99和pRNAi-U6.1/Neo-let-7c。另外将pRNAi-U6.1/Neo-NC(对照片段)作为对照载体。鉴定结果显示成功构建miRNA表达载体。(二)细胞水平的研究：选择A549细胞和Hela细胞作为研究对象进行转染,48h后用Real-time PCR等方法检测两种miRNA的表达情况,进一步通过荧光显微镜、流式细胞术和电子显微镜检测细胞的增殖和凋亡情况,结果发现：转染miRNA表达载体后miR-99及let-7c在细胞中有效表达,并能抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。三、Let-7c调节TRB2及相关因子在肺癌发病中的作用(一)pcDNA3.1-TRB2载体的构建：将PCR扩增的TRB2-cDNA克隆至pcDNA3.1载体中,作为TRB2基因的表达载体(pcDNA3.1-TRB2)。(二)Let-7c对TRB2相关因子表达的影响：通过信息分析及相关研究发现,TRB2基因可能的下游相关因子包括P-38、AKT、EBP-a/EBP-β蛋白等。在A549细胞中转染pcDNA3.1-TRB2、RNAi-TRB2、let-7c表达载体后,RT-PCR检测结果示：构建的TRB2基因干扰载体(RNAi-TRB2)和表达载体(pcDNA3.1-TRB2)能有效抑制和增强TRB2基因表达,而miRNA-let-7c也能负调控TRB2基因表达,在此基础上用Western blot检测p-p38和P38蛋白的表达变化,结果示：TRB2和let-7c基因都能引起p-p38表达量的改变,表明TRB2和let-7c基因能通过P38信号因子在肺腺癌的发病中发挥作用。综上所述,在肺癌A549细胞中miR-99和let-7c可以作用于TRB2基因3’UTR端,负性调控TRB2基因的表达。在该细胞株中低表达的TRB2基因和高表达的let-7c都能引起P38信号因子磷酸化水平增高,最终抑制细胞增殖,促进肺腺癌细胞凋亡。