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研究背景和目的鼻咽癌(NasoPharyngeal Carcinoma,NPC)是一种主要发生在我国南方地区的鼻咽部恶性肿瘤,由于NPC发生的部位比较隐蔽,早期症状常不明显而容易被忽略,因此确诊的患者60%以上都是中、晚期病例,常伴有转移发生。寻找鼻咽癌发生发展及转移的机制,是我们当前研究的主要方向。肿瘤的形成和侵袭转移是一个多步骤、多阶段、多因子参与的复杂而又连续的过程,涉及了一些关键的癌基因和抑癌基因。在前期研究中,我们利用cDNA微阵列检测了鼻咽癌组织、混合的鼻咽癌细胞(5-8F、6-10B和CNE2)与非癌鼻咽组织间的差异表达基因,经BRB软件分析,真核翻译起始因子(eukaryotic translation initiation factors,EIFs)EIF4G1在鼻咽癌组织和细胞中表达明显上调,提示该基因可能正向参与促进了鼻咽癌的发病过程。EIF4G1作为一个“支架蛋白”,使其它与翻译起始有关的因子与之结合而发挥各自的作用。近年来越来越多的研究发现表明,EIF4G1除了促进蛋白翻译外,也与肿瘤的发生、进展密切相关。该基因有报导在喉癌、肺癌、乳腺癌中表达明显增高,促进了肿瘤细胞蛋白翻译、肿瘤血管生成、细胞恶性转化和抗凋亡。为了阐明/EIF4G1基因在鼻咽癌发病中的作用,我们利用RNAi技术高效、特异的靶向沉默机制干扰鼻咽癌细胞5-8F中EIF4G1表达,建立稳定靶向干扰EIF4G1表达的siRNA鼻咽癌细胞,以观察干扰EIF4G1后,鼻咽癌生物学功能改变,为鼻咽癌的发病机制和治疗提供新的思路。方法1.EIF4G1在鼻咽癌中的表达特性鉴定免疫组化SP法从蛋白水平检测EIF4G1在非癌鼻咽炎组织和鼻咽癌中的表达水平,初步探讨EIF4G1在组织水平与鼻咽癌发生发展的关系。荧光定量PCR法从mRNA水平检测EIF4G1在永生化鼻咽上皮细胞NP69和鼻咽癌细胞5-8F、6-10B、C666-1、CNE1、CNE2、HNE1、HONE1、SUNE1中的表达水平,初步探讨EIF4G1在永生化鼻咽上皮细胞和鼻咽癌细胞中的表达差异,并找到高表达EIF4G1的鼻咽癌细胞作为下一步干扰对象。2.EIF4G1表达沉默对鼻咽癌细胞生物学影响构建EIF4G1慢病毒干扰、阴性对照载体,包装成成熟的慢病毒颗粒感染高表达EIF4G1的5-8F细胞,筛选出稳定的阳性和空载克隆,荧光定量PCR检测各干扰克隆细胞中EIF4G1干扰效率,筛选干扰效率最高的细胞克隆。在western-blot验证干扰后EIF4G1蛋白表达水平后,该细胞克隆作为实验对象被进一步研究。MTT法、流式细胞术及平板克隆形成实验检测EIF4G1沉默后对细胞体外增殖的影响;Transwell和boyden小室分别检测EIF4G1沉默后细胞迁移运动和侵袭能力的改变;裸鼠皮下移植瘤实验来观察EIF4G1沉默后裸鼠体内成瘤能力的影响。3.统计学方法采用SPSS 13.0统计软件包进行统计学处理,第一章中因免疫组化各指标均为等级资料,故其组间的比较采用非参数秩和检验,EIF4G1的表达在非癌鼻咽组织和鼻咽癌比较采用Mann-Whitney U检验;EIF4G1的表达与鼻咽癌病理分化的关系检验用Kruskal WaUis Test,检验水准均取双侧α=0.05;荧光定量PCR法检测鼻咽癌细胞株EIF4G1表达特性结果比较采用单因素方差分析,多重比较采用SNK检验。第二章中荧光定量PCR、运动、侵袭实验、平板克隆形成实验和细胞周期采用单因素方差分析;MTT采用析因设计的方差分析;多重比较采用SNK或LSD检验;裸鼠皮下移植瘤采用配对样本t检验。结果1、EIF4G1在鼻咽癌中的表达特性鉴定1)共收集鼻咽炎组16例、鼻咽癌组40例临床标本。SP免疫组化结果表明,EIF4G1表达主要定位在细胞膜和细胞浆。EIF4G1在鼻咽癌和非癌鼻咽炎组织中的表达差异有统计学意义(Z=—3.971,P=0.000),EIF4G1的表达情况与临床病理分化没有统计学意义(χ~2=2.508,P=0.285)。2)荧光定量PCR法检测EIF4G1在永生化鼻咽上皮细胞NP69和鼻咽癌细胞5-8F、6-10B、C666-1、CNE1、CNE2、HNE1、HONE1、SUNE1 mRNA水平表达差异有统计学意义(F=31.575,P=0.000),5-8F表达最高,表达量为NP69 EIF4G1表达量的19.5倍,作为下一步干扰对象。2、EIF4G1表达沉默对鼻咽癌细胞生物学影响1)构建慢病毒干扰载体和阴性对照载体,包装慢病毒后感染5-8F细胞,杀稻瘟菌素筛选抗性克隆,荧光定量PCR检测各克隆的EIF4G1表达情况,筛选出干扰效率最高的克隆(99%)为下一步实验的研究对象,Western blot验证干扰后蛋白表达效率。阳性克隆的干扰效率与5-8F和阴性对照细胞表达差异有统计学意义(F=11.897,P=0.000),同时检测EIF4G1在阴性对照中的表达相对于5-8F强度较一致(1.009±0.066)。阳性干扰克隆命名为5-8F/pshRNA-EIF4G1~-,阴性对照克隆为5-8F/pshRNA。2) MTT法检测细胞增殖情况,与阴性对照5-8F/pshRNA和5-8F细胞相比,干扰克隆细胞5-8F/pshRNA-EIF4G1~-的增殖速度明显减慢并且呈时间依赖关系,有统计学差异(F=131.448,P=0.000);western-blot结果显示5-8F/pshRNA-EIF4G1~-细胞EIF4G1表达下调80.1%;流式细胞术结果也表明各组细胞中S期和G2/M期变化具有统计学差异(F=22.426,P=0.002和F=7.354,P=0.024),EIF4G1干扰后影响细胞的细胞周期正常移行,阻止S期细胞进入G2/M期,造成5-8F/pshRNA-EIF4G1~-S期细胞聚集,G2/M期细胞减少;平板克隆形成实验显示三组细胞的克隆形成率差异有统计学意义(F=54.615,P=0.000),5-8F/pshRNA-EIF4G1~-细胞克隆形成减少,5-8F和阴性对照组差异无统计学意义(P=0.732)。综合表明EIF4G1表达干扰后,5-8F细胞体外生长被显著抑制。3) Transwell小室检测结果显示,与5-8F和5-8F/pshRNA细胞相比,5-8F/pshRNA-EIF4G1~-细胞穿过聚碳酸酯膜的细胞数减少,差异具有显著性(F=38.329,P=0.000);Boyden小室检测结果显示三组细胞的的侵袭能力具有显著性差异(F=6.170,P=0.014),5-8F/pshRNA-EIF4G1~-细胞的侵袭能力显著降低,说明EIF4G1表达沉默降低了5-8F细胞的体外迁移和侵袭能力。4)将5-8F/pshRNA-EIF4G1~-和5-8F/pshRNA细胞分别对称接种于裸鼠上肢腋窝和下肢腹股沟,21天后解剖取瘤块并称重,上、下肢成瘤的5-8F/pshRNA和5-8F/pshRNA-EIF4G1~-细胞移植瘤重量差异均有统计学意义(P=0.032,P=0.041),表明干扰EIF4G1对裸鼠移植瘤生长产生影响;移植瘤免疫组化结果表明,EIF4G1在干扰组中的表达明显下调,提示干扰克隆在体内成瘤后EIF4G1仍维持于低表达的状态。结论1、免疫组化SP法证实EIF4G1的表达与鼻咽癌的发生发展有关系。2、荧光定量PCR法检测EIF4G1在永生化鼻咽上皮细胞NP69和鼻咽癌细胞5-8F、6-10B、C666-1、CNE1、CNE2、HNE1、HONE1、SUNE1中的表达有差异,5-8F表达最高。3、利用慢病毒载体和RNAi技术建立了EIF4G1表达稳定下调的5-8F细胞株,干扰后细胞体内、外生物学功能明显改变。