植酸酶的发酵生产及其应用

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植酸酶作为饲料添加剂受到广泛关注,其发酵生产及应用值得研究。 试验首先研究了毕赤酵母高密度发酵表达黑曲霉源植酸酶,比较了中试生产过程中不同发酵时间、pH值、溶氧、菌体浓度、铵氮对酶活的影响,同时比较五种不同来源植酸酶在不同pH值,不同温度条件下的酶活特性、耐酸稳定性和蛋白酶对其降解作用。结果表明,发酵时间、pH值、溶氧、菌体浓度、铵氮与酶活关系密切。本试验所用菌种发酵的植酸酶与其它五种不同来源的植酸酶在pH值、温度、耐酸性、抗蛋白酶的降解破坏等方面,因菌种的差异略有差异。 对大肠杆菌源的基因工程菌appA进行高密度发酵,比较10批产品酶活的变化,制定生产工艺流程,同时对产植酸酶的酶学特性进行了研究。结果表明,利用该工艺进行高密度发酵生产10批产品,酶活的变化差异不大,具有相对的稳定性。该重组植酸酶appA的最适pH为4.5,最适温度为60℃,在pH2-7之间酶活均能维持在80%以上,具有很好的pH稳定性;在60℃下保温30min,剩余酶活性为40%:Ca<2+>、Fe<2+>、Mg<2+>Mn<2+>及EDTA对AppA有轻微的激活作用,酶活性分别促进12.2%、4.5%、13.8%、13.4%及16.9%;其余金属离子Zn<2+>、Cu<2+>、Ba<2+>对AppA的酶促反应均有不同程度的抑制作用,分别抑制65.4%、55.3%及8.2%,SDS抑制植酸酶活性23.7%:具有非常好的抗胃蛋白酶水解能力和部分抗胰蛋白酶水解的能力。 植酸酶活性体外评价的试验采用无淀粉麸皮,在37℃,保温12h,比较植酸酶在pH为5.5、5.0、4.0、2.6过程中无机磷的溶出情况,结果显示,无机磷的溶出随着时间的延长、pH的升高而增大。同时确立了无淀粉麸皮的植酸酶酶解的基本方法,评价了15种商品植酸酶在不同pH值下对植酸磷的释放。结果显示酶活测定在较为粗略的程度上还是有很重要的作用,测定10000U/g酶活的植酸酶在上述4个pH值上所产生的磷的量比5 000U/g酶活的植酸酶高;单个酶样中的pH图谱中能够清晰看出在4个pH值的酶,从而可以推测该酶在体内不同消化环境中的酶学活性的变化,从而寻求与动物实验中数据的相关性。比较不同产品的酶学特性,显示康地恩植酸酶的酶学特性较好,在偏碱性pH值的表现在同类产品中最好,在酸性条件下也不逊色于其他产品,有利于植酸酶在动物体内发挥作用。 大肠杆菌源的植酸酶appA中试生产应用研究结果表明,实验室中该酶具有较高的比活性,适合大规模的工业化生产。但是,该工程菌移植工厂生产后,由于设备工艺等诸多方面的条件限制,发酵液效价未能达到技术要求,通过对该植酸酶工程茵的工艺进行改进,可获得更高的酶活。液态植酸酶的稳定性试验,选用大分子有机物、醇类、无机盐、氨基酸等为备选试剂,分别进行单因子的不同浓度筛选,比较不同试剂对该重组植酸酶AppA热稳定性的影响。在此基础上,筛选具备高效保护作用的试剂进行组合,通过正交实验设计复合因子实验,选取最佳组合。复合组合的稳定剂保护效果较好,确保该重组植酸酶AppA液体酶制剂在25℃1个月内剩余酶活>95%。 为解决饲料厂使用植酸酶时高温制粒对酶活的不利影响,采用液体植酸酶后喷涂工艺及KDN-MPPM液态酶后喷涂设备,用于全价饲料加工过程中,向饲料颗粒表面喷涂微量液态酶制剂,在设备的基础上组合形成液体植酸酶的应用系统。后喷涂的精确度和均匀度是该工艺的关键,精确度较易控制,但均匀度涉及喷雾的压力、喷嘴结构、饲料和酶的称量传感器精度及其平行对应控制,是系统的问题。通过对饲料中植酸酶的检测证实,7000U/ml的植酸酶按万分之一添加到颗粒饲料中,每克颗粒饲料含酶0.7u,无法用常规方法检出。但通过延长酶解时间,提高酶解率,能较好地检出颗粒饲料中微量植酸酶。雾化后喷涂的酶液,均匀度很高,CV%<10%,完全满足饲料均匀度需要,并可检出饲料中植酸酶含量。 试验选用216只300日龄罗曼产蛋鸡,比较饲料中不添加植酸酶与添加0.06%的植酸酶对基础日粮中磷酸氢钙和磷的用量的影响。结果表明:基础日粮中若不添加植酸酶,则降低有效磷含量会影响鸡只的生产性能。添加0.06%植酸酶后,饲料配方中总磷即使为0.44%,只要日采食粮>113克,该酶仍能起到分解饲料中植酸磷的作用,蛋鸡的生产性能不受影响。 比较植酸酶对肉仔鸡免疫功能、肠道菌群及生产性能的影响,选用120只1日龄双AA肉鸡,雌雄各半,在营养水平相同的情况下比较使用植酸酶日粮与普通日粮的鸡群在1-42日龄出栏时各生长阶段肉鸡的生产性能、淋巴细胞比率、免疫器官指数、巨噬细胞吞噬指数及盲肠内容物中大肠杆菌数量的差异。结果显示,试验组添加0.6%植酸酶后,前中后三期日粮配方中磷酸氢钙用量较对照组分别降低18.8%、24%和36%;添加植酸酶后,试验组较对照组平均日增重提高12%,其中雌性试验组与雌性对照组相比出栏体重增加396克,平均日增重提高22.6%,表现差异极显著;植酸酶的使用能够有效降低盲肠大肠杆菌数量,雄性植酸酶组在不同日龄段大肠杆菌数量降幅分别达到23%,34%和50%,雌性植酸酶组降幅平均达到50%。本试验显示添加植酸酶后肉鸡巨噬细胞吞噬指数、免疫器官指数均出现不同程度下降。 采用1620只36~44周龄的产蛋鸡进行30天试验,比较相同基础日粮中添加五种不同来源的植酸酶在日产蛋率、日产蛋重、日破蛋数、破蛋数、周耗料、料蛋比、死淘率方面的差异。结果表明,组间的总采食量、总产蛋量及总产蛋重差异皆不显著;BF、XP和康地恩植酸酶用于产蛋鸡饲料的效果差异也都不显著。其中平均产蛋率以康地恩酶组效果最优(91.27%),较对照组提高了3.56%。其它处理组差异较小。全期料蛋比以BF组最低;而对照组、CH酶、XP三个处理组最高,比BF组提高了1.70%。全期破蛋数(枚)对照组和xP两个处理组极显著高于其它处理组,以XP和CH酶两个处理组最低。全期鸡只死淘数仍以对照组和XP两个处理组微高,其它处理组接近。 参考营养指标和植酸酶的潜在营养价值并结合当前原料市场价,比较添加植酸酶前后肉鸡、肉鸭料配方变化带来的经济效益的变化,表明添加组肉鸡料每吨可节省成本9.47-11.51元,肉鸭料每吨节省成本4.51-7.85元,对月产一万吨全价禽料厂进行收益计算,其中鸡料5000吨/月,鸭料5000吨/月,每吨料加酶成本降低平均肉鸡料按8元/吨,肉鸭料按平均5元/吨,企业收益=5000×8+5000×5=6.5万/月。
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