研究背景和目的微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一类内源性的非编码单链RNA,广泛存在于真核细胞中,被认为是一类极具应用潜能的新型生物标志物,有望在疾病诊疗和预后判断等方面发挥重要作用。然而,成熟miRNA的片段短、丰度低、具有高序列同源性,因此为其检测技术带来一定的挑战。当前,miRNA的传统检测方法包括Northern印迹杂交、微阵列芯片和实时荧光定量PCR法,这些方法在灵敏度、特异性及便捷性等方面均存在固有缺点,难以被推广应用。近年来,酶促等温扩增信号放大技术的发展使miRNA检测的灵敏度得到提高,但由于蛋白酶成本较高,易变性失活,因而限制了其广泛应用。相比而言,基于DNA纳米技术的无酶放大技术为miRNA快速检测提供新的思路,近年来已成为了研究者们关注和研究的热点。鉴于此,我们设计了一个循环miRNA介导的催化茎环自组装体系,利用2-氨基嘌呤荧光探针作为信号输出分子,建立一种无酶、免标记、高效便捷的miRNA荧光检测新方法,并对该方法的检测性能进行评价,为临床生物样品中miRNA的高敏检测提供新的思路和研究基础。研究方法1.催化茎环自组装体系构建以及反应条件优化1.1设计并合成反应体系所需要的各类核酸和茎环探针,并对茎环结构探针的各类物理参数进行计算和评估。1.2利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对催化茎环自组装体系的反应产物进行分析,考察靶miRNA对于触发自组装过程的能力以及两组茎环结构探针的结合情况,验证该方法的可行性。1.3 比较不同比例的两组茎环探针浓度、探针的加入浓度、反应温度、反应时间等条件下,体系所产生荧光信号强弱的变化,从而优化出最佳反应条件。2.无酶、免标记的miRNA检测方法性能评价及其实际应用能力评估2.1在已优化的最佳反应条件下,用所构建的体系对不同浓度的miRNA-21标准品进行检测,计算得出该方法的检测限及线性范围,从而对传感器的检测灵敏度进行评价。2.2用所构建的方法同时对miRNA-21以及几种不同错配程度的RNA序列进行检测,评估该方法的碱基错配识别能力,从而评价其检测特异性。2.3收集临床血清标本,将不同浓度的miRNA-21加入样品中进行回收实验,计算方法的回收率和RSD值,评估所构建方法的实际应用能力。结果1.利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对该反应体系产物进行表征,结果显示,靶miRNA-21能成功启动自组装反应,产生大量P1-P2复合物,证明了 miRNA介导的催化茎环自组装体系构建成功,反应能顺利进行。2.对所构建检测方法的关键检测条件进行优化,结果显示P1与P2的最佳浓度比例为1.5:1,P2的最佳加入浓度为500 nM,最佳反应温度为37℃,最佳孵育时间为30 min。3.在已优化的最佳反应条件下对传感器的检测性能进行评价,得出传感器的检测下限为1 nM,线性范围为1 nM—800 nM。检测体系能够有效区分单碱基错配序列,具备优异的检测特异性。对临床血清标本进行回收实验,得出该方法的回收率在98.48%—103.16%区间内,初步证明该方法的具有良好的实际应用能力。结论本研究结合催化茎环自组装的高效性和高特异性,利用2-氨基嘌呤在单链中能发出强烈荧光而在双链中荧光信号猝灭的特性,初步创建出一种无酶、免标记的miRNA荧光快速检测新方法。该方法可检测低至1 nM的miRNA-21,能识别低至一个碱基差异的miRNA,展现出了良好的检测特异性,同时该方法还具备良好的实际应用能力,在临床血清标本miRNA定量分析方面具备潜在的实用价值。