北美一球悬铃木组织培养及利用安全筛选标记基因进行耐盐转基因研究

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土壤盐渍化是一个世界性问题,在盐碱地上植树造林不仅可以改良和利用盐碱地,而且可以带来明显的经济效益和生态效益,因此,耐盐树种的选育是国内外林木育种工作者关注的热点问题。北美-球悬铃木(Platanus occidentalis L.)作为一种重要的园林绿化和工业用材树种,开展其组织培养和遗传转化研究是培育该树种耐盐新品种的有效途径。本文选用北美-球悬铃木为研究材料建立其体外组织培养再生体系,并在此基础上进行了耐盐Na+/H+逆向转运蛋白基因(AtNHX1)的遗传转化研究,主要结果如下: 1)利用北美-球悬铃木叶片外植体,通过对分化、生根和移栽等体外再生过程的研究,建立了北美-球悬铃木高效稳定的体外再生体系。其分化培养基为WPM+6-BA(5.0mg1-1)+IBA(0.1mg1-1)+蔗糖(3%),最大分化率达到90%,平均芽个数为13.72;壮苗培养基为MS+6-BA(0.3mg1-1)+NAA(0.03mg1-1)+腺嘌呤(2%)+蔗糖(3%):生根培养基为1/2MS+IBA(0.1mg1-1)+蔗糖(2%)。北美-球悬铃木再生苗经RAPD分子标记检测发现由组织培养引起的多态率在0.0104%以下,表明北美-球悬铃木体外再生植株遗传稳定性好。 2)利用本实验室构建的含安全选择标记基因manA和耐盐AtNHXl基因的双T-DNA表达载体进行了北美-球悬铃木耐盐基因遗传转化研究,通过甘露糖敏感性测验发现,随甘露糖浓度增加,北美-球悬铃木不定芽分化率降低,表明北美-球悬铃木对甘露糖敏感,不能直接利用甘露糖进行代谢反应,因此可以利用甘露糖对转基因植株进行筛选;受体叶片与农杆菌共培养后,在含不同浓度的甘露糖和蔗糖的分化培养基上进行分化,不定芽经PCR检测结果显示,在含10g1-1甘露糖和15g1-1蔗糖的培养基上其转化效率为12.76%,因此确定该浓度组合为北美-球悬铃木甘露糖筛选适宜的选择压。 (3)以北美-球悬铃木叶片为受体材料,通过根癌农杆菌介导转化和甘露糖筛选,获得了一批经PCR和氯酚红(CPR)检测均呈阳性的耐盐转基因植株。
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