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【研究背景及目的】肝硬化是由于慢性肝损伤导致肝组织出现纤维束包裹的再生小结,从而进一步导致门脉高压和终末期肝病。肝硬化在目前全球导致死亡的常见病因中排行第14位,在发达国家的发病率和死亡率正呈上升趋势。目前治疗肝硬化的新理念是通过预防和早期干预来稳定疾病进程,延缓临床失代偿期出现和避免肝移植,因此,对肝硬化早期诊断相当必要。肝活检虽然是肝硬化诊断金标准,但仍存在一些临床应用局限性,如可能出现严重并发症,检查者与取样标本的差异等。进一步建立和更新有效、无创的诊断方法用于肝硬化的临床诊断及预后评估仍具有很大的应用价值。单个血清指标用于肝硬化的诊断往往存在局限性,目前临床上多采用联合指标以提高诊断准确率。常用的肝硬化临床血清无创诊断指标包括天冬氨酸氨基转移酶/血小板比值指数(AST/PLT ratio index,APRI)、基于四因素肝纤维指数(fibrosis index based on the4 factors,FIB-4)、天冬氨酸氨基转移酶/丙氨酸氨基转移酶比值(AST/ALT ratio,AAR)等,但是这些血清无创诊断指标往往存在准确率不高,特异性较差等缺点,临床应用不理想。非编码RNA(non-coding RNA,nc RNA)是一类不能被翻译成蛋白的RNA。nc RNA按大小可以分为:长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA),短链非编码RNA(short non-coding RNA,snc RNA)。微小RNA(micro RNA,mi RNA)属于snc RNA的一种,由18-24个碱基组成,主要作用于目标m RNA的靶序列的3’非编码区(3’-untranslated region,3-UTR)。lnc RNA是一类存在于真核细胞内转录本长度超过200nt的RNA,lnc RNA参与了体内多种形式的基因调控,包括转录调控、转录后调控和表观遗传调控等。近年研究发现,包括mi RNA和lnc RNA在内的某些nc RNA不仅在组织和细胞中稳定表达,也稳定存在于血清和血浆中,如mi R-21、mi R-122、肺腺癌转移相关转录本1(Metastasis associated in lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT-1)等,有研究表明,肝硬化患者肝脏组织和血清中的nc RNA表达存在显著的相关性。这些以不同形式存在的nc RNA与包括肝硬化在内的多种慢性疾病的发生及进程关系密切,对其诊断、治疗及预后判断有重要价值。本课题旨在通过检测多种血清nc RNA的表达水平,探讨血清nc RNA在肝硬化无创诊断中的应用价值。【研究方法】第一部分:血清mi R-192和mi R-29a在肝硬化无创诊断中的应用价值1.我们前期的研究结果显示,mi R-192和mi R-29a均与慢性肝病存在着显著的相关性,故选择mi R-192和mi R-29a作为本课题的研究靶mi RNA。收集116例待测血清样本(36例正常对照,80例肝硬化患者),使用mir VanaTM PARISTM试剂盒抽提血清RNA,设计相应引物,使用q RT-PCR的方法测定mi R-192和mi R-29a在血清中的表达水平。联合2个mi RNA运用Logistic回归构建新的数理模型,以ROC曲线的曲线下面积(Area under the curve,AUC)作为肝硬化诊断的可信度,比较单个mi RNA、新数理模型和其它临床常用指标诊断肝硬化的可信度。2.根据Child-Pugh分级评估肝硬化的严重程度,分析mi R-192、mi R-29a、新数理模型与肝硬化严重程度的相关性。第二部分:lnc RNA uc.77+和uc010vfu.1在肝硬化无创诊断中的应用价值1.分别留取4例正常人及5例肝硬化患者的肝组织,处理后进行lnc RNA基因组芯片分析,筛选出上调和下调最明显的各10个lnc RNA作为候选基因,随机选取肝硬化患者和健康对照血清样本各10例,采用q RT-PCR方法对上述20个差异表达明显的lnc RNA进行血清表达分析,筛选出2个在肝硬化组织和血清中差异表达均较明显且表达稳定的lnc RNA—uc.77+和uc010vfu.1。2.留取40例正常人和93例肝硬化患者血清,分别测定血清uc.77+和uc010vfu.1的表达水平,联合2个lnc RNA运用Logistic回归构建新的数理模型,比较单个lnc RNA、新数理模型和其它临床常用指标诊断肝硬化的可信度。3.根据Child-Pugh分级评估肝硬化的严重程度,分析uc.77+、uc010vfu.1、新数理模型与肝硬化严重程度的相关性。【实验结果】1.mi R-192、mi R-29a及联合检测诊断肝硬化的价值运用q RT-PCR技术分别测定36例正常对照,80例肝硬化患者血清中mi R-192和mi R-29a的表达情况,发现相对于对照组,肝硬化患者血清中的mi R-192表达显著上调(P<0.0001),mi R-29a表达则明显下调(P<0.0001)。通过ROC可信度分析发现,mi R-192诊断肝硬化的可信度为0.8844,95%可信区间为0.8175~0.9513,敏感性为86.25%,特异性为83.33%;mi R-29a诊断肝硬化的可信度为0.8837,95%可信区间为0.8226~0.9448,敏感性为76.25%,特异性为86.11%。利用Logistic回归构建以mi R-192和mi R-29a为基础的诊断模型:Risk score=1.469-4.476×mi R-29a+0.979×mi R-192。Risk score作为肝硬化诊断指标其诊断肝硬化的可信度为0.9354,95%可信区间为0.8827~0.9881,敏感性为86.25%,特异性为94.44%。mi R-192、mi R-29a和Risk score诊断肝硬化的可信度均高于APRI(AUC=0.8080)、FIB-4(AUC=0.8174)、AAR(AUC=0.5941)等临床常用血清无创检测指标。2.mi R-192、mi R-29a及Risk score与肝硬化严重程度相关性采用Child-Pugh分级评估肝硬化的严重程度,通过相关性分析发现,mi R-192、mi R-29a和Risk score均与肝硬化严重程度显著相关。mi R-192血清表达水平随着肝硬化程度的加重而升高(P=0.026,Rho=0.248),mi R-29a血清表达水平随着肝硬化程度的加重而降低(P=0.022,Rho=-0.334),Risk score与肝硬化程度呈明显正相关(P=0.005,Rho=0.311)3.lnc RNA基因组芯片分析筛选出差异表达的lnc RNA uc.77+和uc010vfu.1运用lnc RNA基因组芯片分析筛选出20个在正常肝脏组织和肝硬化组织中存在显著差异表达的候选lnc RNA。采用q RT-PCR方法在血清水平验证上述20个lnc RNA,筛选出在肝硬化组织和血清中差异表达均较明显且表达水平稳定的lnc RNA—uc.77+和uc010vfu.1。4.uc.77+、uc010vfu.1及联合检测诊断肝硬化的价值采用q RT-PCR方法分别测定40例正常对照,93例肝硬化患者血清中uc.77+和uc010vfu.1的表达水平。uc.77+和uc010vfu.1在肝硬化患者血清中的表达水平均显著低于对照组,P值均小于0.001。通过ROC可信度分析发现,uc.77+诊断肝硬化的可信度为0.8188,95%可信区间为0.7413~0.8963,敏感性为82.80%,特异性为67.50%;uc010vfu.1诊断肝硬化的可信度为0.8446,95%可信区间为0.7754~0.9138,敏感性为70.97%,特异性为82.50%。利用Logistic回归构建以uc.77+和uc010vfu.1为基础的诊断模型为:Risk score=3.716-[4.007×uc.77+]-[2.445×uc010vfu.1]。Risk score作为肝硬化诊断指标其诊断肝硬化的可信度为0.8849,95%可信区间为0.8224~0.9475,敏感性为70.97%,特异性为90.00%。uc.77+、uc010vfu.1和Risk score诊断肝硬化的可信度均高于APRI(AUC=0.7637)、FIB-4(AUC=0.7715)、AAR(AUC=0.5575)等临床常用无创检测指标。5.uc.77+、uc010vfu.1及Risk score与肝硬化严重程度相关通过相关性分析发现,血清uc.77+及uc010vfu.1表达水平随着肝硬化程度的加重而降低,与肝硬化严重程度呈显著负相关(Rho=-0.621,P<0.01;Rho=-0.582,P<0.01)。Risk score与肝硬化严重程度呈显著正相关(Rho=0.675,P<0.01)。【结论】1.nc RNA—mi R-192、mi R-29a、uc.77+、uc010vfu.1在血清中稳定存在,在肝硬化患者血清中表达异常。2.mi R-192、mi R-29a以及uc.77+、uc010vfu.1诊断肝硬化的可信度优于其它临床常用血清无创检测指标,且联合诊断肝硬化的可信度优于单一nc RNA。3.mi R-192、mi R-29a以及uc.77+、uc010vfu.1的表达水平与肝硬化严重程度存在显著相关性。