论文部分内容阅读
目的利用同位素标记相对和绝对定量等量异位标签(iTRAQ)偶联在线二维液相色谱串联质谱(2D LC-MS/MS)的蛋白质组学技术,比较大鼠感觉和运动神经元蛋白质表达谱,通过生物信息学分析对差异表达蛋白进行功能分类和信号通路分析,为寻找神经趋化性生长的机制提供理论和实验基础。方法1.取13.5d胎鼠的脊髓和背根节,分别采取免疫包被法和梯度离心的方法获得并纯化感觉和运动神经元,通过免疫细胞化学染色和流式细胞仪鉴定纯度。2.提取感觉和运动神经元细胞总蛋白,BCA法检测蛋白浓度。SDS-PAGE电泳后银染,检测蛋白质品质。3.蛋白样品经过丙酮沉淀、酶解和iTRAQ标记后,利用高效液相(UltiMate3000-HPLC)进行分离,质谱检测收集数据。4.通过对质谱检测获得的蛋白质定量分析获得差异表达蛋白,利用生物信息学的方法对差异表达蛋白进行功能分类和亚细胞定位。5.通过Western blot、免疫组织化学染色(IHC)和免疫细胞化学染色(ICC)对部分差异表达蛋白的表达进行验证。6.通过生物信息学方法对差异表达蛋白进行信号通路分析,筛选出差异表达蛋白所体现的显著性信号通路。7.在感觉和运动神经元培养中加入Sema3A重组蛋白检测对其对神经元突起长度和数量的影响,研究Sema3A对感觉和运动神经元生长的作用差异。结果1.获得纯化的感觉与运动神经元,流式细胞仪检测感觉神经元中NF的表达和运动神经元中的ChAT表达,结果显示感觉与运动神经元纯度均为90%以上,并用免疫细胞化学染色进行纯度鉴定结果显示感觉神经元与运动神经元纯度良好。2.SDS-PAGE电泳后银染显示蛋白条带清晰,提取的感觉与运动神经元的蛋白质样品质量佳。3.共鉴定到3005种蛋白(Unused≥1.3(Confidence≥95%),FDR<1%),其中2986种蛋白具有定量信息。通过定量分析差异表达蛋白一共227个,其中感觉/运动比值大于等于2倍即感觉神经元高表达蛋白质122个,小于0.5倍即运动神经元高表达蛋白质105个,大约7%的蛋白差异表达,提示两种神经元存在着较大差异。4.将感觉与运动神经元差异表达蛋白的生物学功能分类显示,感觉神经元高表达蛋白功能主要涉及线粒体能量、脂质生物合成、蛋白质合成、细胞骨架、受体和信号、细胞周期、细胞质囊泡等;运动神经元高表达蛋白功能主要涉及新陈代谢、RNA的加工、染色质的修饰、囊泡、轴突和细胞骨架、受体和信号、细胞周期、蛋白质的折叠和修饰、物质运输等。感觉与运动神经元差异表达蛋白亚细胞定位分析显示,感觉神经元高表达蛋白61%定位于细胞质,17%定位于质膜,15%定位于细胞核;运动神经元高表达蛋白50%定位于细胞质,32%定位于细胞核,14%定位于质膜。5.Western blot结果显示神经纤维网蛋白(Neuropillin1,Nrp1)、神经丝蛋白中链(Neurofilament Medium,NF M)、磷脂结合蛋白(Annexin V)、神经丝蛋白轻链(Neurofilament Light,NF L)和外周蛋白(Peripherin)等在感觉神经元中高表达;胶质细胞成熟因子beta(Glia Maturation Factor Beta,GMFB)和神经细胞粘附因子(Neural Cell Adhesion Molecule,NCAM)在运动神经元中高表达,结果和质谱检测结果一致。6.细胞免疫化学染色显示感觉神经元中的NF M、Advillin、PlexinA1表达均高于运动神经元。7.免疫组织化学染色验证出NF M在背根节感觉神经元中的表达高于脊髓前角中运动神经元的表达。8.感觉与运动神经元差异蛋白的信号通路研究分析显示,在与轴突导向相关信号通路中差异表达Sema3A及其受体有较多相互联系和作用。9.Sema3A重组蛋白分别作用于感觉和运动神经元,结果显示感觉神经元平均突起的数量和长度的减少程度都较运动神经元高。结论1.在建立感觉和运动神经元纯化方法的基础上,采用iTRAQ偶联2D LC-MS/MS的定量蛋白质组学技术,比较了感觉与运动神经元蛋白质表达谱之间的差异,通过生物信息学分析发现差异蛋白质一共227个,其中感觉神经元高表达蛋白质122个,主要涉及脂质生物合成、蛋白质生物合成和细胞骨架等;运动神经元高表达蛋白质105个,主要涉及新陈代谢、RNA的加工和染色质的修饰等。对差异表达蛋白进行信号通路分析发现其与轴突导向相关信号通路中SemaA及其受体有相互联系和作用。2.Sema3A对感觉与运动神经元的作用可能存在选择性差异,对感觉神经元的作用较强。