抗氧化益生乳酸菌筛选及其对IPEC-J2细胞氧化损伤的保护作用

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断奶仔猪腹泻是影响养猪业发展的重要疾病,现如今已经成为全球范围内养猪产业的重要难题之一。由于其发病率高而且危害严重,给养猪业带来了严重的经济损失。产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)则是造成断奶仔猪腹泻的重要病原体,流行病学调查显示,F4+ETEC占据优势地位。研究表明,断奶仔猪腹泻发生时,仔猪肠道出现明显的氧化应激,已有报道显示乳酸菌可以缓解氧化应激,但作用机制尚未完全明确。从抗氧化损伤的角度探讨提高防控断奶仔猪腹泻的效果有望成为一个新的途径。所以本试验在筛选抗氧化益生菌株的基础上,应用细胞氧化应激模型、产肠毒素大肠杆菌感染细胞模型,从细胞和分子水平探究Nrf2信号通路在具有强抗氧化能力的益生乳酸菌抗细胞氧化应激、抵抗产肠毒素大肠杆菌损伤中的作用。所得出的主要结果如下:首先,通过初步分菌,经过革兰氏染色、形态观察和触酶试验的初步筛选,从中国东北传统手工奶酪中共得到322株符合标准的菌株。再次筛选通过模拟体外胃肠道环境,进行耐受强酸、胆盐和胰蛋白酶的测定,筛选出符合标准的菌株。符合标准的23株菌株对常见的五种病原菌具有良好的抑制效果并具有较强的清除自由基能力。随之,对这23株具有优良益生性质的强抗氧化能力菌株进行16S rRNA鉴定,确定菌株分别是植物乳杆菌(16)、屎肠球菌(2)、副干酪乳杆菌(2)、瑞士乳杆菌(1)、魏斯氏菌(1)和戊糖片球菌(1)。最后,测定其安全性,疏水性及其药物敏感性,综合结果筛选出6株能力最好的乳酸菌菌株。分别分离这六株乳酸菌的胞外多糖、表面活性剂及小分子蛋白等不同组分,并测定不同组分的抗氧化能力。从中选择具有最优秀益生性质、体外抗氧化能力的植物乳杆菌27197进行后续试验。之后,首先建立H2O2氧化应激损伤模型,评价植物乳杆菌27197对氧化应激的缓解效果,并解析其缓解氧化应激的机制。分别设立对照组、H2O2损伤组、乳酸菌(LAB)菌液上清-细胞组、LAB菌液上清-H2O2-细胞组、LAB菌液-细胞组和LAB菌液-H2O2-细胞组,观察细胞形态学变化,检测氧化应激相关指标,并检测Nrf2信号通路、炎症因子和肠道黏膜屏障相关mRNA或蛋白表达水平。结果表明,植物乳杆菌27197能明显缓解细胞受到的氧化损伤,减轻氧化应激导致的细胞形态损伤,缓解氧化应激引起的炎症反应。其次,建立产肠毒素大肠杆菌CVCC230(K88)感染细胞模型,评价植物乳杆菌27197对大肠杆菌对肠道损伤的缓解效果,并解析缓解机制。分别设立对照组、K88损伤组、LAB菌液上清-细胞组、LAB菌液上清-K88-细胞组、LAB菌液-细胞组和LAB菌液-K88-细胞组,检测结果表明,K88感染肠道上皮细胞早期存在明显的氧化损伤。植物乳杆菌27197能够具有明显的缓解作用,检测的相关指标趋于正常细胞组。植物乳杆菌27197可以降低K88引发炎症因子转录水平,并且提高肠道细胞紧密连接因子的转录水平,表明植物乳杆菌27197在体内可以抑制K88引发的炎症反应,并且维护肠黏膜屏障功能。试验还发现,植物乳杆菌27197能够调控Nrf2信号通路相关因子来保护细胞,并能够下调K88毒力因子的转录水平。本研究证实植物乳杆菌27197能够调节Nrf2信号通路的相关抗氧化蛋白的表达,具有缓解氧化应激作用,并且发现保护机制与维护肠黏膜屏障功能、调节细胞因子表达及影响K88毒力因子表达等有关。植物乳杆菌27197有望用作绿色安全的制剂来预防K88引起的断奶仔猪腹泻,为下一步将抗氧化益生乳酸菌添加到动物饲料奠定基础。试验结果将为揭示具有强抗氧化能力的益生乳酸菌在缓解断奶仔猪腹泻导致的小肠上皮细胞氧化应激反应和抗大肠杆菌损伤的作用机制提供理论依据,并为益生乳酸菌的科学应用提供理论依据。
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