多溴联苯醚(polybrominated diphenylethers,PBDEs)是一种具有价格低廉、添加量少、阻燃效率高且对材料性能影响较小等优点的溴代阻燃剂(brominated flameretardants,BFRs),已广泛应用于电子电气设备、电缆、建筑材料、家具和纺织品等商业产品中。PBDEs因不易与聚合物共价结合而易释放到环境中,且难以降解,是一类新的环境持久性有机污染物(persistent organic pollutants,POPs),已在多种环境介质、动物以及人类组织中检测到,且含量呈逐年增加的趋势。体内和体外实验已发现,PBDEs对人体健康可造成多种危害,包括肝脏毒性、生殖毒性、神经毒性及神经发育毒性、内分泌干扰作用及致癌作用等。多项动物实验和人群流行病学调查数据表明,暴露PBDEs能影响神经系统的发育,主要表现为认知能力下降,行为能力紊乱和学习记忆能力缺损,且随年龄增长而加重。婴幼儿容易通过母乳和室内尘埃暴露PBDEs,其体内PBDEs含量在不同年龄段人群中最高,因此PBDEs的神经发育毒性受到广泛关注。然而,目前有关PBDEs神经发育毒性的毒作用机制研究仍较少,因此针对PBDEs神经发育毒性的毒作用机制展开研究意义重大,有利于深入认识其神经毒作用特点,为预防控制PBDEs神经发育毒性提供理论依据。　　细胞凋亡(Apoptosis)是细胞程序性死亡(Programmed Cell Death,PCD),对维持机体内细胞动态平衡和胚胎发育非常重要。细胞凋亡异常如不凋亡或过度凋亡均会造成诸多疾病的发生,且多与外源化合物的刺激作用有关。Ca2+作为细胞内的第二信使对维持细胞正常生理功能具有重要意义,然而细胞在外界刺激下,细胞内钙稳态的改变则会诱导细胞凋亡,细胞内钙离子浓度(intracellular free calciumionconcentration,[Ca2+]i)升高是细胞凋亡过程中普遍存在的事件。线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,ΔΨm)下降与细胞内钙超载有关,是细胞凋亡早期的标志性事件。近年来已有研究发现,暴露PBDE-99和PBDE-153后大鼠海马中的胆碱能受体发生改变,而且PBDE-99还能诱导人星形细胞瘤细胞凋亡,在用PBDE-99染毒的人星形细胞瘤细胞、星形胶质细胞、巨噬细胞和PC12细胞中均观察到PKCs活化和[Ca2+]i升高。本实验室前期研究也发现PBDE-47能诱导人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)及原代培养的大鼠海马神经元DNA损伤和凋亡,并在凋亡过程中观察到[Ca2+]i升高,由此推测:PBDEs神经发育毒性的毒作用机制可能是PBDEs破坏细胞内钙的稳态而诱导神经细胞凋亡。　　PBDE-47是人体和环境中含量最高的PBDEs同系物之一,SH-SY5Y细胞的形态和生理性质与正常神经细胞类似,是研究神经细胞毒性的常用细胞模型。因此,本实验拟用不同浓度PBDE-47对SH-SY5Y细胞进行染毒,研究PBDE-47致SH-SY5Y细胞凋亡过程中[Ca2+]i变化及其机制,为进一步开展PBDE-47神经毒作用机制研究提供理论依据。　　本研究主要由以下二部分组成。　　第一部分：PBDE-47对SH-SY5Y细胞[Ca2+]i和ΔΨm的影响　　目的:研究PBDE-47对体外培养的SH-SY5Y细胞[Ca2+]i和ΔΨm的影响。　　方法:将体外培养的SH-SY5Y细胞暴露于不同浓度PBDE-47(1、5、10μmol/L),以DMSO作为溶剂对照,分别利用Ca2+荧光探针1-[2-Amino-5-(2,7-dichloro-6-hydroxy-3-oxo-9-xanthenyl)phenoxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraaceticacid,pentaacetoxymethylester(Fluo-3/AM)和线粒体膜电位(ΔΨm)检测荧光探针5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanineiodide(JC-1)孵育染色细胞,通过激光扫描共焦显微镜(laserscanningconfocalmicroscope,LSCM)动态观测染毒1h内[Ca2+]i的动态变化,并用流式细胞术(flowcytometry,FCM)检测染毒24h内不同时间点的[Ca2+]i水平和染毒24h后ΔΨm的变化情况以及细胞凋亡率。　　结果:10μmol/LPBDE-47染毒细胞24h后,细胞的早期凋亡率和总凋亡率均明显高于对照组、1μmol/LPBDE-47染毒组和5μmol/LPBDE-47染毒组。各染毒组的[Ca2+]i在染毒1h内均明显升高(P<0.05),且存在剂量-效应关系。与对照组相比,10μmol/LPBDE-47染毒组在3h、6h、12h、24h时间点的[Ca2+]i均出现不同程度的升高(P<0.05);5μmol/LPBDE-47染毒组在3h、12h、24h时间点的[Ca2+]i也明显升高(P<0.05),而1μmol/LPBDE-47染毒组仅在6h时间点出现[Ca2+]i的明显升高(P<0.05)。染毒24h后5μmol/L和10μmol/LPBDE-47染毒组与对照组相比ΔΨm显著下降(P<0.05),但1μmol/LPBDE-47染毒组的ΔΨm变化无统计学意义(P>0.05)。　　结论:PBDE-47导致[Ca2+]i早期且持续升高和ΔΨm下降,细胞内钙信号紊乱可能是PBDE-47诱导细胞凋亡过程中的早期事件,且与ΔΨm变化有关。　　第二部分：PBDE-47致SH-SY5Y细胞凋亡过程中[Ca2+]i变化机制及其与ΔΨm之间的关系　　目的:探索PBDE-47导致[Ca2+]i升高的原因及其与ΔΨm间的关系　　方法:对体外培养的SH-SY5Y细胞分别用细胞外钙离子螯合剂EGTA和细胞内钙离子螯合剂BAPTA/AM将细胞内和细胞外的Ca2+螯合(其中BAPTA/AM在染毒前预处理细胞30min;而EGTA在染毒时加入DMEM培养基中,作用时间与染毒时间一致),再用10μmol/LPBDE-47染毒24h,然后通过FCM检测[Ca2+]i和ΔΨm的变化情况。　　结果:对照组与EGTA组和BAPTA/AM组之间[Ca2+]i和ΔΨm差异没有统计学意义(P>0.05),说明EGTA和BAPET/AM对SH-SY5Y细胞[Ca2+]i和ΔΨm没有影响,不具有明显毒性作用。与对照组相比,10μmol/LPBDE-47组和10μmol/LPBDE-47+BAPTA/AM组[Ca2+]i升高且ΔΨm下降(P<0.05),而10μmol/LPBDE-47+EGTA组[Ca2+]i和ΔΨm差异没有统计学意义(P>0.05),说明EGTA能抑制PBDE-47导致的[Ca2+]i升高和ΔΨm下降。　　结论:PBDE-47导致的SH-SY5Y细胞[Ca2+]i升高是由细胞外Ca2+内流所致,且[Ca2+]i升高可能是ΔΨm下降的主要原因。