大豆是世界上重要的经济作物之一，为人类提供了28%（大豆食用油占世界食用油总量）的食用油和67%（大豆蛋白的消费量占全球蛋白粉消费总量）的蛋白源。此外，由于大豆能与根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）共生互作形成新的植物器官--根瘤，具有每年以每公顷一百公斤的效率将氮气转化为氨再转化为能被植物同化的脲类化合物的能力，供植物吸收，所以大豆亦是一种对环境十分友善的作物，更适合应用于轮作、间作和套作等可持续发展农业模式中。因此，大豆对于保障我国粮油战略安全和农业可持续发展都具有十分重要的意义。光是影响大豆生长发育以及品质的最重要的环境因子之一。它不仅为大豆提供了光合作用所需要的能源，同时提供给大豆各种光质信号。光能够起作用主要是通过调节幼苗早期的光形态建成以及光周期反应共同实现的。生育期是光周期反应的重要指标，与大豆的产量和质量密切相关，生育期的长短决定着大豆种植的地理纬度及种植季节。大豆是喜温的敏感短日照作物，黑龙江省是我国大豆主产区。近年来，由于受到高产作物水稻和玉米的冲击，黑龙江省大豆主要种植区域已经由I、II积温带（有效积温大于2500°C）逐渐向北转移到第III、IV、V积温带，而黑龙江省III、IV、V积温带地处我国高纬度地区，气候寒冷，无霜期短，积温少，北移速度过快，品种选育并未跟上，所以这一地区急需对光周期反应不敏感的早熟或超早熟大豆新品种。因此，研究大豆相关基因参与调控光信号途径及光周期反应的分子机制可以为在分子水平上选育和定向改造适宜品种提供理论依据。为了感知生长环境中的各种光信号并对它们的变化及时做出响应，大豆进化出一系列光受体，通过光受体间的调节作用使得大豆的生长同外界环境一致。光敏色素是一类重要的光受体，主要负责感知红光和远红光。光敏色素吸收光并通过一系列与其相互作用的蛋白，共同将光质信号向下传递，在光形态建成以及光周期反应过程中起到重要的调控作用。本实验室前期研究结果表明，大豆生育期E4基因位于I连锁群上SSRmaker:satt496和satt354之间，编码大豆光敏色素A2（GmPhyA2）。对E4近等基因系的解析发现，e4是由于在第一个外显子插入一个LTR型反转录转座子而造成该基因失活的突变类型。在研究过程中，我们又发现了另外四种E4基因的等位变异类型（e4），分别为克霜型（kes），乙女型（oto），机4型（tsu4）和釜石型（kam），它们在E4位点的第一个外显子上并没有插入LTR型反转录转座子，但是与e4表型相同。序列分析发现这四个e4基因编码的GmPhyA2在不同程度上缺少C端结构域（即PAS和HKRD结构域），可能使光敏色素的光信号传导功能受到影响。目前，光敏色素在大豆光信号通路中的调控作用目前还不是很清楚。基于上述主要研究成果，本研究首先通过对大量不同基因类型材料茎节数，开花期，生育期的调查以及基因表达的分析，结果表明至少有三个基因，E1，E3和E4参与控制大豆光周期的不敏感性并且光敏色素在大豆开花后茎的生长和豆荚发育具有调控作用。通过拟南芥遗传转化技术使e4基因过量表达，鉴定出在e4等位变异类型中，GmPhyA2缺失的C端结构域对幼苗早期光形态建成起重要作用。接下来，利用酵母双杂交方法，验证了GmPhyA2与其候选结合因子GmPIF3之间的相互作用并进一步采用双分子荧光互补技术确定了它们的这种互作关系。为了鉴定筛选到的GmPIF3因子的功能，运用大豆遗传转化法获得转基因后代，观察其表型进而阐明GmPIF3因子在光形态建成中的功能以及在光周期途径中可能起到的作用，旨在为完善E4基因参与的大豆光信号调控通路提供理论依据。主要研究结果如下：1.证明E1，E3和E4调控大豆开花后茎的生长以及豆荚的发育对来自世界各地的53份光周期不敏感材料进行基因型鉴定，根据鉴定结果，将他们分为6组。在日本札幌的自然光照条件（ND）以及人工诱导的长日照条件（LD）下，处理各种材料，发现在这两种条件下，开花时间没有明显差异，表明E1，E3和E4参与控制大豆光周期的不敏感性。但开花后的营养生长时期各材料存在着较大差异，表明E1，E3和E4控制大豆开花后豆荚的发育。同时，E3和E4共同调节大豆有限结荚习性基因Dt1基因的表达。表明E3和E4在开花后的营养生长以及生殖生长过程中，对大豆茎的生长发育具有重要作用。2.明确GmPhyA2的C端结构域对大豆幼苗的光形态建成具有调控作用为了验证e4基因的功能，我们分别构建过表达载体，转化拟南芥，观察转基因拟南芥植株与拟南芥phyA突变体植株下胚轴生长情况发现，在远红光条件下，两种植株下胚轴长度相似，均比野生型伸长。这一结果表明，突变体中PhyA2缺失的PAS与HKRD结构域在GmPhyA2参与的早期光形态建成中对下胚轴的生长有影响。3.确定GmPhyA2与Glyma19g41261.2编码的GmPIF3相互作用关系以拟南芥PIFs因子（AtPIFs）的cDNA序列为信息探针搜索Phytozome大豆数据库(Phytozome: http://www.phytozome.net/soybean)，利用MEGA4.0对获得的序列进行进化树分析，发现有三条序列可以与AtPIF3聚在一起，它们编码的蛋白均含有bHLH结构域以及与光敏色素相互作用的APB结构域。设计特异引物获得这三条GmPIF3基因的cDNA全长，将它们分别命名为：GmPIF3-a（Glyma10g28290.1）、 GmPIF3-b （Glyma19g41261.2）、 GmPIF3-c（Glyma20g22291.1）。以GmPhyA2的C端结构域作为诱饵，利用酵母双杂交系统验证GmPhyA2与三个GmPIF3间的相互作用，结果发现GmPhyA2可以与GmPIF3-b（Glyma19g41261.2）编码的GmPIF3互作，而与其他两个GmPIF3之间无互作。通过双分子荧光互补技术对GmPhyA2与GmPIF3-b之间的互作做进一步验证，发现它们之间的确存在着相互作用。4.初步证明GmPhyA2与光系统中的蛋白存在相互作用分别在长日照（16h光照/8h黑暗）和短日照（8h光照/16h黑暗）条件下处理大豆材料Harosoy，提取三出复叶的总RNA，构建大豆酵母双杂交cDNA文库。以GmPhyA2的C端为诱饵，筛选文库。初步获得了可激活报告基因的32个阳性克隆。对筛选到的阳性克隆进行PCR鉴定和测序分析，结果表明其中有7个克隆含有正确读码框。将获得的序列与Phytozome数据库进行同源性比对，发现其中有3个基因可能是光系统中的基因。但他们编码的蛋白与GmPhyA2的相互作用有待于利用双分子荧光互补技术进行深入验证。5.阐明GmPIF3在幼苗光形态建成中负调控下胚轴生长.筛选到可以与GmPhyA2相互作用的GmPIF3，为了验证编码该蛋白的基因GmPIF3-b的功能，我们构建过表达载体，通过农杆菌介导的大豆遗传转化法将该基因转化入大豆品种东农50。在T2代转基因株系中，该基因过量表达。在低R：FR比的白炽灯条件下，观察转基因株系与东农50下胚轴生长情况，发现转基因大豆具有较长的下胚轴，表明GmPIF3可以负调控下胚轴的生长。同时，统计各植株开花情况，结果发现，转基因株系开花期延长，这可能与GmPIF3因子的作用有关，但此结果需要进一步验证。