PARTI:众所周知,在成熟之前脱去卵丘细胞（cumulus cells, CCs）会破坏卵母细胞的成熟质量,然而,在一些胚胎工程技术中,在卵母细胞的不同成熟阶段脱去卵丘细胞却是必需的,因此建立高效的裸卵（denuded oocytes, DOs）体外成熟系统对于一些胚胎工程技术来讲具有非常重要的应用价值。此外,这一成熟系统的建立对于进一步了解卵丘细胞促进卵母细胞成熟的具体机制也具有重要的理论指导意义。谷胱甘肽作为细胞内重要的巯基还原物质,是卵母细胞成熟质量的重要指标,尽管目前有许多研究者都通过向培养液中添加半胱胺、胱氨酸等小分子巯基物质来促进卵母细胞的谷胱甘肽（glutathione, GSH）合成来提高卵母细胞的成熟质量,但是这些巯基成分促进卵母细胞GSH合成的具体机制还不清楚。在本实验中我们主要研究了半胱胺、胱氨酸、卵丘细胞以及卵母细胞在促进小鼠卵母细胞胞质中谷胱甘肽的过程中如何相互作用,并在此基础上建立一种高效完善的小鼠裸卵体外成熟系统。我们的研究结果表明：1)小鼠卵丘卵母细胞复合体（cumulus oocyte complexes, COCs）本身不能利用培养液中的半胱胺和胱氨酸,但是胱氨酸和半胱胺能够相互作用促进小鼠COCs胞质中的GSH合成；2)山羊COCs能够单独利用培养液中的胱氨酸或者半胱胺来合成自身的GSH；3)单独向培养液中添加胱氨酸和半胱胺不能促进小鼠DOs胞质中的GSH合成,同时添加则能够显著提高小鼠DOs中的GSH水平。与小鼠CCs共培养时趋势与之相同。与山羊CCs能单独利用胱氨酸或者半胱胺促进共培养小鼠DOs胞质中的GSH合成水平,同时添加胱氨酸和半胱胺能进一步提高小鼠DOs胞质中的GSH水平；4)单独添加胱氨酸或者半胱胺不能提高促进与小鼠DOs共培养的小鼠CCs的GSH水平,但是能够促进山羊CCs中的GSH合成水平。同时添加胱氨酸和半胱胺才能促进小鼠CCs中的GSH合成,而对于山羊CCs来讲,则能进一步提高其GSH水平；5)胱氨酸和半胱胺同时添加时才能在单独培养的M16培养基以及与小鼠CCs共培养的M16培养基中检测到半胱氨酸的存在。当M16培养基与山羊CCs共培养时,单独添加胱氨酸或者同时添加胱氨酸和半胱胺均能检测到半胱氨酸的产生；6)单独添加胱氨酸不能改善成熟后小鼠COCs的胚胎发育能力。当添加200μM胱氨酸的基础上继续添加100μM或者200μM半胱胺时,囊胚发育率达到最高；7)在与小鼠CCs共培养情况下,同时添加最佳浓度的半胱胺（100μMor200μM）和胱氨酸（200μM）能使小鼠体外成熟的DOs的孤雌激活胚胎发育能力达到与相同条件下成熟的小鼠COCs的水平；8)对不同条件下成熟的小鼠卵母细胞进行体外受精。最佳条件下成熟的COCs和共培养DOs之间受精后的囊胚率没有差异;9)通过胚胎移植实验发现最佳成熟条件下成熟的小鼠COCs和小鼠卵丘细胞共培养的DOs来源的2-cell细胞胚胎经输卵管移植到假孕母鼠后出生的后代数目没有差异,说明已经建立了最佳的小鼠DOs体外成熟系统；10)小鼠和山羊CCs中胱氨酸转运体系Xc-中调节亚基xCT mRNA表达没有差异,说明小鼠卵丘细胞不能利用胱氨酸并不是由于缺乏胱氨酸转运系统；11)山羊CCs中胱氨酸还原酶的活性也显著高于小鼠CCs,因此我们认为造成小鼠卵丘细胞不能利用胱氨酸的原因主要就是其胱氨酸还原酶活性太低。总之,通过本研究我们主要获得以下结论：1)小鼠卵丘细胞不能够单独利用培养液中的胱氨酸或者半胱胺,但是山羊卵丘细胞则可以；2)山羊卵丘细胞能够通过还原培养液中的胱氨酸为半胱氨酸促进小鼠卵母细胞的GSH合成；3)小鼠DOs不能单独利用周围环境中的胱氨酸或者半胱胺,但是当合适浓度的胱氨酸和半胱胺以及卵丘细胞同时存在时,小鼠DOs的发育能力则可以完全恢复；4)小鼠卵丘细胞之所以不能利用周围环境中的胱氨酸主要因为其缺乏胱氨酸还原酶的活性。PART Ⅱ:随着社会的发展,人们面临的压力（应激）越来越大。有研究也表明,女性更易受到应激相关的心理疾病的影响。应激会造成机体多方面的损伤,从繁殖学的角度讲,应激会造成雌性生殖内分泌紊乱或退化性疾病和女性早衰,从遗传学的角度讲,急性或者慢性应激会造成多种体细胞的遗传损伤,那么应激是否会影响卵母细胞的染色体或者DNA状态呢?在本实验中,我们利用本实验室建立的束缚应激模型,详细研究了注射PMSG后24h进行束缚应激处理24h对卵母细胞非整倍体的影响,并通过对MI期卵母细胞纺锤体组装和染色体结构及排队,卵母细胞胞质中纺锤体检验点蛋白MAD2的表达以及卵母细胞胞质中氧化还原状态的变化等方面探讨了束缚应激造成卵母细胞非整倍性的可能机制。研究结果表明：1)束缚应激能够造成小鼠卵母细胞孤雌激活胚胎囊胚发育率降低,囊胚细胞数减少,胚胎发育进程明显变慢；2)束缚应激都会造成小鼠MII期卵母细胞出现染色体非整倍性的比例增加；3)束缚应激对小鼠MII期卵母细胞染色体姐妹染色单体提前分离情况没有显著的影响；4)束缚应激导致小鼠卯母细胞经孤雌激活后非整倍体胚胎的比例显著增加,说明胚胎时期的染色体异常主要由于卵母细胞染色体异常造成；5)束缚应激造成小鼠卵母细胞体外成熟过程中MI和A/TI进程变短,第一极体排出加快；6)束缚应激能够对小鼠MI期卵母细胞纺锤体组装和染色体排队造成不利影响,但是并没有影响MI期染色体数目,也没有造成同源染色体的提前分离；7)束缚应激造成小鼠卵母细胞MAD2蛋白表达出现紊乱,应激组GV期卵母细胞中MAD2蛋白表达量显著高于对照组,而pMI期MAD2蛋白表达量则低于对照组；8)束缚应激造成小鼠卵母细胞胞质中还原型谷胱甘肽水平显著降低,GSH/GSSG比值下降,说明应激组卵母细胞中巯基抗氧化能力下降,换言之,束缚应激造成小鼠卵母细胞出现氧化应激。我们认为,束缚应激导致的氧化应激可能是其对卵母细胞造成遗传损伤的主要病理学机制,氧化应激会造成小鼠卵母细胞纺锤体组装和染色体排队的异常,也会导致纺锤体检验点机制的失败,从而最终导致了小鼠卵母细胞出现染色体非整倍性。