巨噬细胞膜包被糖脂药物递释系统构建与抗肿瘤序贯靶向免疫治疗

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PD-L1抗体和免疫佐剂CpG的作用位点,分别位于肿瘤细胞表面和树突状细胞内,已有的肿瘤免疫联合治疗,缺乏针对药物作用位点明确的选择性,影响联合应用药效的发挥。实现针对药物免疫治疗不同作用位点的序贯靶向及靶向基础上的药物释放,是一个亟待解决的问题。本研究选用生物可降解阳离子材料壳寡糖(Chitosan oligosaccharide,CSO)为基本骨架,嫁接硬脂酸(Stearic acid,SA),构建阳离子壳寡糖硬脂酸嫁接物(Stearic acid-g-chitosan oligosaccharide,CSO-SA),通过化学合成得到甘露糖修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物(Mannose grafted stearic acid-g-chitosan oligosaccharide,M-CSO-SA),嫁接物水性介质中自聚集形成胶束,利用壳寡糖结构中荷正电的氨基,密接免疫佐剂CpG,构建免疫药物递释系统(M-CSO-SA/CpG)。采用抗PD-L1多肽(PPA)修饰的巨噬细胞膜Mem-PPA,包被药物递释系统,构建抗PD-L1多肽修饰巨噬细胞膜包被的免疫药物递释系统(M-CSO-SA/CpG@Mem-PPA)利用M-CSO-SA的质子海绵效应,首先在肿瘤微环境中脱落包被在外的Mem-PPA,释放PPA,内核M-CSO-SA/CpG在肿瘤微环境中继续捕获抗原,并将CpG与肿瘤相关抗原递送至树突状细胞,实现一个药物递释系统内两种药物的序贯靶向与分别释放,显著提高树突状细胞表面CD86和CD80的表达。经测定,M-CSO-SA/CpG@Mem-PPA表面电位为6.85±0.72 mV,在p H 7.4PBS水性介质中,粒径为100.4±6.22 nm。当p H值由7.4降低至类似肿瘤微环境的p H 6.5时,粒径仪测得M-CSO-SA/CpG@Mem-PPA的粒径由100.4±6.22 nm增大至865.6±97.3 nm,出现双峰。透射电镜下观察,当p H值由7.4降至p H 6.5,M-CSO-SA/CpG@Mem-PPA表面脂双层结构消失。紫外分光光度计测定M-CSO-SA/CpG免疫药物递释系统的CpG载药量为7.38±2.3%,包封率为95.7±3.9%。构建细胞模型,CLSM观察到脱离细胞膜后的M-CSO-SA/CpG可以捕获游离抗原,并将其递送至树突状细胞。细胞竞争性摄取研究显示,M-CSO-SA胶束主要经甘露糖受体通路被DC2.4细胞摄取。流式细胞仪检测结果显示,与CpG和游离抗原组相比,捕获抗原后的M-CSO-SA/CpG,其树突状细胞CD80和CD86的平均荧光强度,分别由2.26±0.26和2.70±0.08增加至16.57±0.53和5.29±0.26,明显增强CpG诱导DC细胞成熟活化的能力。建立小鼠4T1乳腺癌动物模型,巨噬细胞膜包被可明显提高M-CSO-SA/CpG/ICG药物递释系统的乳腺癌组织分布,实现乳腺癌靶向。模型动物药效学研究结果显示,M-CSO-SA/CpG@Mem-PPA的抑瘤率为82.3%,明显高于CpG与PPA联合给药组的48.9%。经流式细胞仪测定,与PPA+CpG联合用药组相比,M-CSO-SA/CpG@Mem-PPA肿瘤部位T细胞的CD8+/IFN-γ和CD4+/IL-4双阳性百分比,分别由0.75%和0.66%增加至1.33%和1.05%,免疫组化研究结果显示,M-CSO-SA/CpG@Mem-PPA显著提高肿瘤部位CD8+T细胞与CD4+T细胞的浸润。研究结果揭示,M-CSO-SA/CpG@Mem-PPA可通过提高树突状细胞的成熟与抗原提呈能力,增加CD4+T细胞和CD8+T细胞的活化,强有力地激活体内抗肿瘤免疫反应,本研究可为未来的抗肿瘤免疫治疗提供新的策略。
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