背景与目的巨噬细胞作为一种异质性的细胞群体,在不同的微环境中表现出不同的活化状态,被赋予明显不同的功能。M1型巨噬细胞通过参与正向免疫应答发挥抗感染和抗肿瘤的功能,而M2型巨噬细胞下调免疫应答,介导病原体和肿瘤的免疫逃逸。在非小细胞肺癌发生发展过程中巨噬细胞的活化状态如何,与机体的局部及全身免疫状态关系如何,其活化状态受哪些因素调控尚未见文献报道。本课题通过流式细胞仪检测非小细胞肺癌外周血、肿瘤组织及癌旁组织M1及M2巨噬细胞标志性分子；同时比较肿瘤不同部位巨噬细胞功能差异以明确非小细胞肺癌巨噬细胞的活化状态。免疫组化进一步检测癌组织和癌旁组织中巨噬细胞不同活化状态标志分子的表达,研究非小细胞肺癌巨噬细胞活化与预后及临床病理参数的关系。通过检测细胞因子、免疫细胞标志分子的表达,研究其与巨噬细胞不同活化状态的关系,探讨巨噬细胞发生不同活化的可能机制。最后通过体外实验探讨细胞因子对巨噬细胞活化的影响及非小细胞肺癌发生免疫逃逸的可能机制。材料与方法1.用流式细胞术检测10例健康对照外周血和22例非小细胞肺癌患者外周血、肿瘤组织、瘤旁组织中CD16+CD14+和B7-H1+CD14+的巨噬细胞表达情况,分析不同亚型巨噬细胞与非小细胞肺癌临床病理特征的关系。2.用巨噬细胞吞噬功能测定比较肿瘤内和肿瘤旁组织分离出的巨噬细胞功能差异。3.用免疫组织化学通过对肿瘤原位巨噬细胞分子标志CD68、M1型巨噬细胞标志分子TNFα、CD16及M2型巨噬细胞标志分子CD206、B7-H1进行定量及定性分析,研究其与非小细胞肺癌的临床病理参数和预后的关系。4.用免疫组织化学方法对非小细胞肺癌的细胞因子IL-10、TGF-β1,免疫细胞如调节性T细胞、NK细胞、PD-1+淋巴进行定量及定性分析,以探讨肿瘤局部免疫状态与巨噬细胞活化表型的关系,分析细胞因子对巨噬细胞活化状态的影响。5.免疫组化检测IL-10在人肺癌细胞株A549的表达。体外实验通过对人血源性巨噬细胞进行诱导培养,观察空白对照、IFN-γ+LPS、IL-10,人肺癌细胞株A549的细胞培养上清,A549的细胞培养上清加IL-10中和抗体五种不同刺激因子对巨噬细胞表型和功能的影响。流式细胞术检测不同诱导组巨噬细胞表型区别；ELISA细胞因子检测、巨噬细胞吞噬功能检测、MTT法同种异体混合淋巴细胞反应检测比较不同诱导组巨噬细胞功能区别,以探讨IL-10对巨噬细胞活化的影响。结果1.非小细胞肺癌巨噬细胞活化亚型的表型和功能(1)非小细胞肺癌患者外周血B7-H1+CD14+细胞占CD14+单核细胞比例为3.91±1.54%高于健康对照组外周血2.13±0.86%(P<0.05)；肿瘤组织内B7-H1+CD14+细胞占CD14+巨噬细胞比例为42.88±3.52%显著高于癌旁组织17.76±2.74%(P<0.001),肿瘤组织中的B7-H1+CD14+的平均荧光强度119.40±18.56%高于癌旁组织45.86±9.86%(P＜0.001)。(2)非小细胞肺癌患者外周血CD16+CD14+细胞占CD14+单核细胞比例为20.35±3.54%高于健康对照组外周血10.49±1.82%(P<0.001)；肿瘤组织中CD16+CD14+细胞占CD14+巨噬细胞比例为7.76±2.38%显著低于癌旁组织17.76士2.52%(P＜0.001)；肿瘤组织中的CD16+的平均荧光强度35.63±1.76%低于癌旁组织45.86±2.35%(P＜0.05)。(3)肿瘤内B7-H1+CD14+细胞比例和CD16+CD14+细胞比例与临床分期、肿瘤大小有关,与年龄、性别、组织学分级、组织学类型,淋巴结转移无关。(4)肿瘤内巨噬细胞吞噬鸡红细胞百分率30.21±1.73%低于肿瘤旁巨噬细胞吞噬鸡红细胞百分率38.11±2.35%(P＜0.05)。肿瘤内巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬指数0.86±0.09低于肿瘤旁巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬指数0.97±0.15(P＜0.05)。2.非小细胞肺癌巨噬细胞活化亚型的临床意义TNF-α阳性巨噬细胞在癌组织内阳性率21.28%显著低于交界区48.93%及癌旁肺组织42.10%(P<0.05)。CD16阳性巨噬细胞在癌组织内阳性率34.04%显著低于交界区51.16%及癌旁肺组织78.94%(P<0.05)。CD206阳性巨噬细胞在癌组织内阳性率65.95%、交界区阳性率74.41%均显著高于癌旁肺组织阳性率36.84%(P<0.05)。B7-H1在癌组织内阳性率48.93%、癌边缘为74.41%均显著高于癌旁肺组织阳性率31.57%(P<0.05)。肿瘤组织内TNFα、CD16蛋白的表达与非小细胞肺癌患者的临床分期负相关,与生存期呈正相关。肿瘤组织内CD206、B7-H1蛋白的表达与非小细胞肺癌患者临床分期正相关,B7-H1蛋白的表达与生存期呈负相关。肿瘤内M1型和M2型巨噬细胞可以作为独立预测非小细胞肺癌患者预后的指标。3.非小细胞肺癌微环境与巨噬细胞亚型的关系(1)IL-10在非小细胞肺癌癌细胞阳性率70.21%高于癌旁肺组织肺泡上皮细胞阳性率26.31%(P<0.05)。IL-10蛋白的表达与患者临床分期正相关、与生存期负相关。IL-10的表达水平和肿瘤内M1型巨噬细胞标志分子表达呈负相关,与肿瘤内M2型巨噬细胞标志分子表达的正相关。(2)肿瘤内CD56+的NK细胞数量低于癌旁组织。肿瘤内FoxP3+的调节性T淋巴细胞及PD-1+的淋巴细胞的数量高于癌旁组织,肿瘤内FoxP3+的调节性T淋巴细胞数量在M2型巨噬细胞标志蛋白表达阳性组明显高于阴性组,在M1型巨噬细胞标志蛋白表达阳性组与阴性组之间无明显差别。4.体外实验探讨IL-10对巨噬细胞活化亚型的影响(1)IL-10在人肺癌细胞株A549阳性表达(2)经LPS+IFN-γ刺激后,巨噬细胞高表达等M1型巨噬细胞相关标志CD16、TNFα,同时巨噬细胞吞噬功能及刺激淋巴细胞增殖功能均较空白对照组提高；经工L-10和人肺癌细胞株A549的细胞培养上清刺激后,巨噬细胞高表达M2型巨噬细胞相关标志B7-H1、IL-1ra,同时巨噬细胞吞噬功能及刺激淋巴细胞增殖功能均较空白对照组及A549的细胞培养上清加IL-10中和抗体组降低。A549的细胞培养上清加IL-10中和抗体刺激后可部分降低IL-10对巨噬细胞吞噬功能及刺激淋巴细胞增殖功能的影响。IL-10参与了巨噬细胞向M2型巨噬细胞活化。结论1.在非小细胞肺癌中同时存在着M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞。在肺癌组织的不同部位两型细胞的比例各不相同,在肿瘤内以M2型巨噬细胞为主,在肿瘤周围肺组织以Ml型巨噬细胞为主。且两型巨噬细胞相关蛋白表达与肿瘤分期及预后相关。提示在肿瘤的发生发展过程中,肿瘤巨噬细胞的类型发生了改变：在肿瘤的早期,巨噬细胞以M1型为主,而在肿瘤的晚期,以M2型为主。肿瘤内M1型和M2型巨噬细胞可以作为独立预测非小细胞肺癌患者预后的指标。2.CD56、FoxP3及PD-1蛋白表达结果均显示,肿瘤内处于一种免疫抑制的状态,肿瘤内FoxP3+的调节性T淋巴细胞数量在M2型巨噬细胞标志蛋白表达阳性组明显高于阴性组,M2型巨噬细胞可能通过提高调节性T细胞数量促进非小细胞肺癌免疫逃逸。3.非小细胞肺癌中癌细胞表达工L-10,与Ml型巨噬细胞标志分子表达负相关,与M2型巨噬细胞标志分子表达正相关。提示抑制性细胞因子工L-10可能是诱导巨噬细胞表型改变的重要因素。4.人肺癌细胞株A549表达IL-10,人重组IL-10和人肺癌细胞株A549的细胞培养上清可诱导血源性巨噬细胞表达M2型巨噬细胞相关分子,且巨噬细胞吞噬功能及刺激淋巴细胞增殖功能均较LPS+IFN-γ和A549的细胞培养上清+IL-10中和抗体诱导的巨噬细胞低。证实IL-10是非小细胞肺癌微环境中诱导巨噬细胞向M2型转变的一个关键性免疫抑制因子。