目的越鞠丸是治疗中医郁证的经典方,其治疗抑郁症作用得到众多临床研究结果支持。我们前期的动物实验与临床研究发现越鞠丸还具有快速抗抑郁的特性,进一步的研究发现越鞠丸可快速提高抑郁症相关脑区海马腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)的表达,并激活PACAP下游PKA-CREB信号,且其抗抑郁作用依赖于CREB的激活。在此基础上,我们提出海马PACAP及相关信号通路作为介导越鞠丸快速抗抑郁的分子神经基础的假说。本项目拟采用电生理、免疫印迹、颅内微注射PACAP激动剂和拮抗剂、RNAi等技术研究越鞠丸的快速抗抑郁机制,包括:1.对海马PACAP表达的依赖性;2.与PACAP下游PKA、CREB等通路的相关性;3.PACAP通路引起的突触可塑性变化的相关性。本项目通过研究PACAP在越鞠丸快速抗抑郁中的作用机制,确立了 PACAP作为快速抗抑郁的新靶点,并为越鞠丸临床应用的扩大提供了科学依据。方法1.电生理实验将昆明小鼠分为3组,分别是口服纯水+腹腔注射生理盐水组、口服YJ+腹腔注射H89组、口服YJ+腹腔注射生理盐水组。对小鼠海马CA1区进行连续性电刺激后,分析比较三组的快兴奋性突触后电位(f-EPSP)的斜率。为了检测PACAP的时程变化,昆明小鼠被分为30分钟、2小时、24小时三批进行小鼠悬尾实验后,各时间点的样品一半用于Western Blot检测,一半用于Real-Time PCR检测。同样时间点的三批小鼠进行海马cAMP水平的检测。2.PACAP侧脑室微注射实验将小鼠分别分为4组:a.手术+生理盐水组b.手术+PACAP 低剂量组(18.75 pmol)c.手术+PACAP 中剂量组(75 pmol)d.手术+PACAP高剂量组(300 pmol)。4组小鼠均在处理后30分钟开始进行悬尾、强迫游泳实验的测试,测试一直持续到处理后第10天。PACAP拮抗剂实验分为4组,分别是:海马注射生理盐水+ 口服生理盐水组,海马注射生理盐水+ 口服YJ组,海马注射PACAP6-38+口服生理盐水组,海马注射PACAP6-38+口服YJ组。4组在灌胃后30分钟到48小时分别进行悬尾实验及强迫游泳实验。PACAP RNAi实验分为4组:a.海马注射阴参病毒+ 口服生理盐水组,海马注射阴参病毒+ 口服YJ组,海马注射PACAP RNAi+口服生理盐水组,海马注射PACAP RNAi+口服YJ组。4组在灌胃后30分钟到48小时分别进行了悬尾实验、强迫游泳实验及糖偏好实验。Western Blot实验检测给药后30分钟小鼠海马PACAP、PKA、CREB、PSD95的蛋白表达。3.单笼喂养的小鼠接受3周的温和应激。最后一次CMS造模后单次给予越鞠丸和氯胺酮处理,处理后2小时、24小时和48小时动物以SPT,OPT,TST,FST和NSF的顺序进行行为学检测。免疫印迹检测昆明小鼠海马的PACAP及BDNF表达。4.越鞠丸石油醚部位快速抗抑郁潜力实验在方法上采用在30min及24h对昆明小鼠进行小鼠悬尾行为绝望测试,Western blot实验检测小鼠海马区BDNF及TrkB蛋白的表达。栀子有效部位实验首先将栀子根据极性大小分得四个部位。在栀子四个部位单次给药后24小时使用小鼠悬尾实验(TST)和强迫游泳实验(FST)来筛选具有快速抗抑郁潜力的栀子下分部位。单次给药有效的部位进一步使用慢性应激模型(CMS),以及包括TST,FST,蔗糖偏好测试(SPT)和新奇抑制摄食实验(NSF)在内的一系列综合行为测试来确认其快速抗抑郁作用。为了测试BDNF信号与栀子有效部位快速抗抑郁作用之间的关联,我们对栀子有效部位单次给药后不同时间点的海马BDNF及TrkB表达进行了测试。栀子石油醚部位下分有效部位的快速抗抑郁研究采用给药后24h进行小鼠悬尾实验、强迫游泳实验和新奇抑制摄食实验来初步筛选具有快速抗抑郁潜力的栀子石油醚有效部位。给药30min后进行悬尾行为实验及给药2h后进行强迫游泳实验以测试栀子石油醚有效部位起效时间。Western blot实验检测2h及24h小鼠海马区BDNF及p-eEF2蛋白的表达。栀子环烯醚萜部位快速抗抑郁实验分为有效剂量初筛实验(初始起效时间点实验和药效持续时间实验)、慢性模型验证实验、分子实验及阻断剂实验。具体采用给药后24h进行小鼠悬尾实验、强迫游泳实验和新奇抑制摄食实验,从高(200mg/kg)、中(100mg/kg)、低(50mg/kg)三个剂量来初步筛选具有快速抗抑郁潜力的栀子环烯醚帖部位。给药2小时及给药30分钟后进行悬尾实验以测试栀子石油醚有效部位起效时间。给药3天、5天、7天组的小鼠分别进行新奇抑制摄食实验、悬尾实验、强迫游泳实验,给药10天及14天的小鼠进行新奇抑制摄食实验。给予慢性温和刺激造模组小鼠中剂量栀子环烯醚帖24小时后依次进行开场实验、糖偏好测试、新奇抑制摄食实验、悬尾实验、强迫游泳实验,给药3天、5天、7天组的小鼠分别进行新奇抑制摄食实验、悬尾实验、强迫游泳实验,给药10天及14天的小鼠进行新奇抑制摄食实验。Western blot实验检测30分钟、2小时及24小时小鼠海马区BDNF的表达。2小时及24小时小鼠海马区PKA、p-CREB及CREB的表达。测试组小鼠腹腔注射PKA阻断剂H89后给予栀子环烯醚帖,分别于给药后30分钟、2小时、24小时进行小鼠悬尾实验。结果1.电生理结果显示,与口服纯水+腹腔生理盐水给药组相比,口服YJ+腹腔生理盐水组长时称增强作用显著的增强。与口服YJ+腹腔生理盐水组相比,口服YJ+腹腔H89组的长时称增强作用显著降低。与空白组相比,给药30min、2h、24h后越鞠丸组小鼠悬尾实验不动时间显著降低。与空白组相比,给药30min后越鞠丸组小鼠海马PACAP蛋白水平及mRNA表达均显著上调,给药2h后越鞠丸组小鼠海马PACAP蛋白水平及mRNA表达无显著变化,给药24h后越鞠丸组小鼠海马PACAP蛋白水平及mRNA表达显著下调。越鞠丸给药30分钟组、给药2小时组与给药24小时组的小鼠海马cAMP水平均无明显变化。2.侧脑室PACAP给药在TST,FST和NSF上显示出抗抑郁样作用。双侧海马注射PACAP拮抗剂或PACAP RNAi能够逆转越鞠丸在TST,FST和NSF上的快速抗抑郁作用。其中,双侧海马PACAP RNAi处理后小鼠海马出现PACAP,PKA,CREB,PSD95蛋白的下调。单次越鞠丸处理能够逆转这种分子变化。3.三周造模后,造模组小鼠出现了一系列抑郁样行为(包括体重、糖偏好和单位摄食量的降低以及摄食潜伏期和悬尾游泳不动时间的延长)。越鞠丸单次给药2h、24h、48h均能显著逆转模型造成的小鼠抑郁样行为。给药后2小时、24小时、48小时,与空白组相比,模型组小鼠海马的PACAP、BDNF表达显著降低,与模型组相比,模型+YJ组小鼠海马的PACAP、BDNF表达显著上调。4.越鞠丸石油醚部位单次给药后从30分钟到24小时均能对其小鼠悬尾的行为绝望行为产生抗抑郁作用。给予越鞠丸石油醚部位30分钟后小鼠海马中的BDNF及其受体TrkB的表达显著上调,且这种抗抑郁的作用机制可持续到给药后24小时。栀子的石油醚部位和正丁醇部位在急性给药后的FST实验中显示出快速抗抑郁的潜力。在急性给药后的TST实验中,GJ-PE的抗抑郁作用时间比GJ-BO更长。在慢性应激模型上,GJ-PE或GJ-BO单次给药显著逆转了模型小鼠在TST、FST、SPT或NSF行为上的抑郁样行为,从而证实了栀子两个部位具有快速抗抑郁作用。分子实验结果显示,GJ-PE单次给药后增加了海马BDNF和TrkB蛋白的表达,而GJ-BO处理并未发现这样的影响。单次给药GJ-PE1后2小时到24小时均能降低小鼠强迫游泳行为的不动时间,同时降低小鼠陌生环境下摄食的潜伏时间。GJ-PE3单次给药24小时后能降低小鼠陌生环境下摄食的潜伏时间。GJ-PE4给药24小时后能增加小鼠陌生环境下的摄食量。给药2小时后,GJ-PE1小鼠海马中的BDNF表达显著上调,而p-eEF2表达显著下调,24小时后小鼠海马中BDNF表达显著下调而p-eEF2表达显著上调。中剂量栀子环烯醚帖在给药30分钟后显著降低了小鼠悬尾实验的不动时间,其抗抑郁作用能够在小鼠悬尾、强迫游泳模型上持续到第7天,在新奇抑制摄食模型条件下能够持续到至少第14天。与越鞠丸类似,在慢性不可预知的温和刺激模型中,环烯醚萜单次给药24小时后,逆转了造模动物糖偏好的降低,悬尾及强迫游泳测试中不动时间的延长,以及新奇抑制摄食实验中单位摄食量的降低和摄食潜伏时间的延长等抑郁-焦虑样行为。其在慢性模型上单次给药的的抗抑郁作用同样能够持续至少14天。分子研究结果提示栀子环烯醚萜单次给药24小时后海马PKA-CREB信号通路的激活,而该时间点的抗抑郁作用不依赖于BDNF的激活;对PKA-CREB信号通路的阻断逆转了其24小时的抗抑郁效应。结论1.越鞠丸急性给药24小时后抗抑郁作用的特异性脑区之一为海马CA1区。越鞠丸给药后昆明小鼠海马中PACAP蛋白及mRNA表达即刻而非持续的增加与其快速抗抑郁作用相关。越鞠丸给药后30分钟到24小时,小鼠海马中的cAMP表达无影响。2.昆明小鼠侧脑室内高中低剂量的PACAP注射均能产生抗抑郁样作用,其抗抑郁效应至少可以持续到注射后第10天。双侧海马PACAP拮抗剂及PACAP RNAi处理阻断了越鞠丸的快速抗抑郁作用。PACAP,PKA,CREB,PSD95蛋白的显著下调与抑郁样行为的发生相关。越鞠丸给药后30分钟的快速抗抑郁作用与PACAP、PKA、CREB、PSD95蛋白的激活相关。3.小鼠海马区PACAP、BDNF下调与抑郁症的发病相关,单次越鞠丸给药能够逆转慢性应激病理模型造成的小鼠海马区PACAP、BDNF表达的下调。4.越鞠丸石油醚部位具有快速抗抑郁的药物潜力且这种潜在的快速抗抑郁作用与BDNF及其受体TrkB的激活相关。栀子的两个部位GJ-PE和GJ-BO在急性给药和CMS模型上表现出快速抗抑郁作用。然而,仅仅GJ-PE作用与小鼠海马BDNF信号通路的激活相关。栀子石油醚的4个下分部位中,GJ-PE1最具有快速抗抑郁潜力,起效时间为给药后2小时,其机制与BDNF的上调及p-eEF2的下调相关。GJ-PE3、GJ-PE4具有部分潜在快速起效抗抑郁药物的特征。GJ-PE2不具有快速抗抑郁作用。栀子环烯醚萜部位可能为栀子和越鞠丸快速持久抗抑郁效应中的关键药物部位。与越鞠丸类似,该部位的快速持久抗抑郁作用依赖于PKA-CREB信号通路的激活。与越鞠丸不同的是,该部位早期抗抑郁作用不依赖于BDNF快速表达的升高。