研究背景：心力衰竭(心衰)是缺血性心脏病、高血压病、瓣膜性心脏病等多种心血管疾病的共同终末阶段。在中国,成年人心衰的患病率约为0.9%,随着人口老龄化社会的发展,人群中心衰患者人数将不断上升。目前针对心衰发病机制的多种治疗手段虽能改善其症状,但心衰患者的5年生存率仍然低于50%,提示在心衰的发生发展过程中可能还有其他未知因素的参与。心衰的病理生理机制极其复杂,多种因素参与其发生发展。近年来发现,在部分心衰患者血清中存在有抗G-蛋白偶联受体家族中几种主要受体(如肾上腺素β1受体、α1受体、胆碱能M2受体、血管紧张素Ⅱ1型受体)的自身抗体。进一步的研究提示,这些自身抗体在心衰的发生发展中具有一定的病理生理意义。β3肾上腺素受体属于G蛋白偶联受体家族,是继β1、β2肾上腺素受体后发现的又一β肾上腺素受体。2005年本研究室发现,心衰患者血清中存在有抗β3肾上腺素受体的自身抗体(Autoantibodies against theβ3-adrenoceptor,β3AA),其阳性率明显高于正常人；对心衰患者的临床资料进行分析发现,β3AA阳性的心衰患者其心脏左室射血分数(Ejection Fraction, EF)明显高于β3AA阴性者,且β3AA阳性的心衰患者其纽约心脏病协会心功能分级(NYHA)相对较低,即β3AA阳性的心衰患者心功能较阴性者好。这些分析结果提示：β3AA可能具有一定的心脏保护作用,但尚需实验研究进一步证实。此外,慢性心衰急性失代偿发作是心衰患者住院及死亡的主要原因,而心肌缺血是慢性心衰失代偿和急性发作的主要诱发因素之一。那么β3AA长期作用于慢性心衰大鼠,-是否能够降低心衰大鼠对心肌缺血／再灌注损伤的敏感性,从而降低心衰导致的死亡率,尚待进一步研究。为此,本研究以慢性心衰大鼠为切入点,通过静脉长期给予β3AA,以大鼠心功能、心重／体重比、血清中脑钠肽水平及心肌细胞凋亡情况为指标,从β3AA是否能够减轻大鼠心衰程度以及是否能降低心衰大鼠对心肌缺血／再灌注损伤的敏感性两方面,观察β3AA对心衰大鼠是否具有心脏保护作用。目的：1.观察β3AA能否减轻大鼠心衰的程度；2.观察β3AA是否能降低心衰大鼠对心肌缺血／再灌注损伤的敏感性。方法：1.β3AA的制备选用8周龄、重量为140-160g、健康雄性Wistar大鼠20只,随机分为对照组与免疫组。以合成的β3AR细胞外第二环氨基酸肽段为抗原(176aa-200aa,R V G A D A E A Q ECHSNPRCCSFASNMP,中国医学科学院上海生物化学院)进行免疫,每隔两周免疫一次,共免疫8周。对照组只注射相应佐剂,方法同免疫组。采用本实验室改良的ELISA方法检测免疫鼠血清中β3AA的水平。利用IgG亲和纯化试剂盒(Mab.Trap Kit)纯化β3AA阳性的免疫大鼠血清中的IgG。将纯化后的IgG进行定量、定性,并常规SDS-PAGE凝胶电泳法检测其纯度。2.腹主动脉缩窄手术：选用10周龄、重量为200-220g、健康雄性Wistar大鼠。用10%水合氯醛(0.3mL／100g)腹腔注射麻醉后,在剑突下1 cm沿正中线作一切口,分离腹主动脉,将7号针头与腹主动脉一并结扎,然后抽出探针形成腹主动脉狭窄(约50%),同时腹腔一次性注射庆大霉素抗感染,分层缝合关腹。3.β3AA输入心衰大鼠模型的制备将提纯的β3AA阳性的IgG,以2μg/g的剂量,通过尾静脉给入腹主动脉缩窄手术后3天的大鼠体内,每10天加强免疫一次,共免疫50天；免疫前1天,经鼠尾取血样,分离血清,用SA-ELISA法检测其中β3AA的水平。对照组以2μg／g的剂量通过尾静脉给入β3AA阴性的IgG,免疫程序和检测方法同上。4.在体心功能的检测应用生物信号记录分析系统MS2000记录各心功能参数,包括左心室收缩压(LVSP),左心室舒张末压(LVEDP)以及左心室内压上升和下降的最大速率(±dp／dtmax)。5.心重／体重比的测定开胸,迅速取出心脏,洗净心腔内积血,去除心脏周围组织及血管,用滤纸吸干水分后,称量全心重,计算心脏重量与体重的比值。6.血清中脑钠肽(BNP)的测定血清中BNP的测定采用ELISA试剂盒(ADL,美国)进行测定,具体操作按照说明书进行。7.大鼠心肌缺血／再灌注手术选取进行腹主动脉缩窄术制备的心衰大鼠,用氨基甲酸乙酯(20%,1g／kg,i.p.)腹腔注射麻醉后,左冠脉前降支结扎30 min后,松开结扎线再灌注3h；假手术组大鼠手术操作相同,将缝合针穿过左冠脉前降支下方,但不结扎。8.心梗面积测定应用TTC染色法,测定β3AA输入的心衰大鼠经历心肌缺血／再灌注手术后心肌梗死面积。9.心肌组织Caspase 3活性测定应用Caspase 3测定试剂盒,检测大鼠心肌组织中caspase 3的活性。10.原位末端标记法(TUNEL)测定心肌细胞凋亡利用原位细胞死亡检测试剂盒(In Situ Cell Death Detection Kit,POD),检测大鼠心肌组织中细胞凋亡数量,并计算心肌细胞凋亡指数。结果：1.β3AA向腹主动脉缩窄术后大鼠转移的时间点选择1.1腹主动脉缩窄术后大鼠心功能随时间变化情况腹主动脉缩窄术后8周,大鼠LVSP、+dp／dtmax和-dp／dtmax明显下降,LVEDP明显升高,心功能开始下降；腹主动脉缩窄术后12周、16周,大鼠心功能进行性恶化(表1)。1.2腹主动脉缩窄术后大鼠血清中β3AA随时间变化情况腹主动脉缩窄术后8周,大鼠血清中β3AA明显升高(0.314±0.02vs.0.22±0.05,P<0.05),术后12周达到高峰,之后开始下降(图1)。以上结果提示,腹主动脉缩窄术后0-8周是大鼠心功能从正常到明显下降的过程,是大鼠心衰发生发展非常重要的时期；而且此期间,是β3AA产生的过程,体外给予β3AA可以单纯研究其对大鼠心脏的保护作用。因此本研究选择在腹主动脉缩窄术后0-8周,研究在大鼠心衰发生发展过程中,p3AA对心脏功能的影响。2.大鼠心衰模型制备成功2.1腹主动脉缩窄术后8周大鼠在体心功能明显下降腹主动脉缩窄术后8周,大鼠LVSP和+dp／dtmax明显下降,LVEDP和-dp／dtmax显著升高。说明,腹主动脉缩窄术后8周,大鼠心衰模型制备成功(图3-6)。2.2腹主动脉缩窄术后8周大鼠心重／体重比增大与伪手术组相比,腹主动脉缩窄术后8周大鼠心重／体重比明显增大。提示,心衰大鼠心脏发生了心肌重构(图7)。以上结果提示,腹主动脉缩窄术后8周,大鼠心脏已经发生明显的心肌重构,而且心功能已经表现出失代偿现象。3.β3AA输入心衰大鼠模型制备成功3.1β3AA输入心衰大鼠的剂量选择分别以0.5μg/g、1μg/g、2μg／g的剂量,将p3AA输入腹主动脉缩窄术后的大鼠,免疫后第1天,采血检测大鼠血清中β3AA的水平。以2μg/g输入后,大鼠血清中β3AA的平均OD值为0.67,与临床相匹配,故作为最终免疫剂量(图8)。3.2β3AA的IgG亚类测定应用ELISA法对β3AA的IgG亚类鉴定结果表明,免疫鼠中的β3AA主要属于IgG2b,还有极少部分属于IgG2a。有研究表明不同的IgG亚类具有不同的代谢半衰期,IgG2b亚类的代谢半衰期为6天左右,IgG2a亚类的代谢半衰期为8天左右。明确β3AA的主要IgG亚类则可以为输入周期的选择提供一定的理论依据(图9)。3.3β3AA输入腹主动脉缩窄术后大鼠,体内β3AA的消除时间测定β3AA输入腹主动脉缩窄术后大鼠第1天,大鼠血清中抗体水平增高,平均OD值为0.67,与对照组相比增高了0.35。抗体水平下降其增高值的一半所需的时间大约为10天。因此本研究将免疫周期确定为10天(图10)。3.4β3AA输入腹主动脉缩窄术大鼠后,血清中β3AA水平维持稳定以2μg/g为免疫剂量,10天为免疫周期,β3AA输入腹主动脉缩窄术后大鼠,定期监测大鼠血清中β3AA水平,发现该抗体水平能够稳定维持(图11)。提示β3AIA输入心衰大鼠模型制备成功。4.p3AA对心衰大鼠具有心肌保护作用4.1β3AA降低心衰大鼠血清中脑钠肽(BNP)水平血清BNP水平与心力衰竭的临床严重程度相平行。实时监测心衰大鼠血清中BNP的水平,腹主动脉缩窄术后2周的心衰大鼠,血清中BNP开始有轻度升高；术后6周,β3AA输入心衰大鼠组血清中BNP水平升高程度低于未进行βsAA输入的心衰大鼠组；术后8周,β3AA输入心衰大鼠组血清中BNP的水平较β3AA未免疫心衰大鼠组明显降低。提示,β3AA输入组大鼠心衰程度相对较轻(图12)。4.2β3AA改善心衰大鼠的心功能腹主动脉缩窄术后8周,β3AA输入组的+dp／dtmax及-dp／dtmax降低幅度均低于未免疫组(图13-16)。4.3β3AA对心衰大鼠的心重／体重比没有明显影响腹主动脉缩窄术后8周,β3AA输入组的心重／体重比较未免疫组没有明显改变(图17)。5.1β3AA降低心衰大鼠对心肌缺血／再灌注损伤的敏感性5.1β3AA改善心衰大鼠经历心肌缺血／再灌注损伤后的生存情况β3AA输入心衰大鼠组经历心肌缺血／再灌注手术后,发现p3AA的输入可以明显延长大鼠心肌缺血／再灌注手术后的生存时间(图19)。5.2β3AA使心衰大鼠经历心肌缺血／再灌注损伤后心梗面积减小β3AA输入心衰大鼠组,经历心肌缺血／再灌注手术后,心梗面积较对照组明显减小(图20)。5.3β3AA使心衰大鼠经历心肌缺血／再灌注损伤后心肌细胞凋亡减少β3AA输入心衰大鼠组,经历心肌缺血／再灌注手术后,TUNEL染色阳性细胞明显减少,心肌组织caspase-3活性明显降低(图21、22)。结论：1.β3AA输入压力后负荷性心衰大鼠后,可以使其心功能恶化程度明显减轻、血清中BNP释放减少；2.当心衰大鼠经历心肌缺血／再灌注损伤时,β3AA可以改善其生存情况,并可以减少心肌缺血／再灌注引起的心肌梗死面积和心肌细胞凋亡。