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背景在骨折的愈合过程中骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)对骨的再生起了重要作用。香烟中的主要成份苯并芘(Benzo[a]pyrene,BaP)是芳香烃受体(arylhydrocarbonreceptor,Ahr)的激动剂,可以负性调控骨量和成骨分化。目的通过临床标本、动物模型、体外实验的研究,分析BaP对MSCs分化能力的影响及作用机制,探讨BaP是否会抑制大鼠骨折愈合的进程。方法本实验总共分为三个部分1.收集来自吸烟人群的人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem,hBMSCs)检测早期成骨标志物碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色和活性,茜素红S染色检测晚期的钙盐沉积。检测芳香烃受体和其靶基因细胞色素P4501B1(cytochrome p4501B1,CYP1B1)的表达情况,验证长期吸烟人群的hBMSCs的Ahr信号通路是否被激活。用BaP处理C3H10T1/2和原代大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells,BM-MSCs),利用MTT和克隆形成实验检测MSCs的增殖及自我更新能力,利用油红O染色,检测MSCs成脂分化能力,化学发光和细胞化学染色检测ALP变化,茜素红S染色检测钙盐沉积,观察MSCs的成骨分化能力。Western Blot检测Ahr信号相关分子的表达情况。为进一步明确其具体机制,采用si Ahr干扰Ahr信号通路,检测si Ahr对BaP作用下MSCs成骨分化能力:化学发光和细胞化学染色检测ALP变化;茜素红S染色检测钙盐沉积;Western Blot检测成骨标志物成骨特异性转录因子(Runt-related transcription factor 2,RUNX2),骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)以及SMAD依赖信号通路TGF-β1/SMAD4和非SMAD信号依赖通路TGF-β1/ERK/AKT的表达情况。BaP激活Ahr信号通路的同时采用TGF-β1抑制剂(LY2157299)验证TGF-β1通路的作用。2.白藜芦醇作为Ahr的天然抑制剂,与BaP共同作用后分别检测成骨分化能力和相关信号通路的表达。体内实验,首先构建大鼠染毒和骨折模型,Western Blot检测BM-MSCs的CYP1B1的表达情况,确保染毒模型构建成功,X线和HE检测骨折愈合情况。用白藜芦醇与BaP共同作用于大鼠,观察骨折愈合情况。3.骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins,BMPs)作为成骨诱导因子,与BaP共同作用后检测成骨分化能力的变化。结果吸烟人群的hBMSCs自我更新及成骨分化能力减弱,并且激活Ahr信号通路以及上调Ahr的靶基因CYP1B1的表达。体外实验证实,BaP抑制MSCs的自我更新及多向分化能力,主要是通过激活Ahr信号通路抑制SMAD依赖信号通路TGF-β1/SMAD4和非SMAD信号依赖通路TGF-β1/ERK/AKT。白藜芦醇作为Ahr的天然抑制剂,可以抑制BaP对MSCs的损害。BMP2和BMP9可以抵消BaP抑制成骨分化的作用。体内实验结果显示,BaP可以抑制大鼠骨折愈合的进程,并且这个作用会被白藜芦醇挽救。结论1.BaP通过激活Ahr抑制TGF-β1/SMAD4和TGF-β1/ERK/AKT损伤MSCs的干性。白藜芦醇可以拮抗Ahr抵消BaP的影响。2.BaP可以抑制骨折的愈合进程,并且这个作用会被白藜芦醇挽救。