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研究背景:磷酸腺苷核糖聚合酶1[Poly（ADP-Ribose）Polymerase 1,PARP1]是PRRP酶家族的典型代表,主要与DNA修复、基因的转录调控、炎症反应及氧化应激有关。研究发现,PARP1参与了多种心血管疾病的病理生理过程,如缺血再灌注损伤、心脏重构以及血管炎症等。但迄今为止,仅发现PARP1经泛素依赖性蛋白酶体途径降解,是否存在其他的降解途径尚不明确。近年来,研究人员发现分子伴侣介导的自噬（Chaperone-mediated autophagy,CMA）参与了包括心血管疾病在内的多种疾病的分子调控。分子伴侣Hsc70（Heat shock protein 70）特异性识别带有“KFERQ”序列的底物蛋白,促进底物去折叠并与溶酶体相关膜蛋白2A（Lysosome-associated membrane protein 2A,LAMP2A）结合,继而进入溶酶体腔被降解。因此,CMA的抑制或过度激活都将引起细胞功能异常,最终导致疾病的发生。根据底物蛋白的特殊性,本团队首次发现PARP1具有“KFERQ”五肽序列。然而在心肌细胞中PARP1能否与Hsc70相结合,以及与CMA之间是否存在调控关系尚不明确。研究目的:本研究试图揭示CMA是否可以调控PARP1的蛋白表达,并进一步阐明在H2O2诱导的心肌细胞损伤中CMA调控PARP1表达的具体分子机制。研究方法:本研究采用原代乳鼠心肌细胞（neonatal rat cardiomyocytes,NRCMs）用于实验研究。1、明确CMA对PARP1表达的调控作用:（1）利用自噬激活剂平衡盐溶液（EBSS）自噬阻断剂氯喹（CQ）以及蛋白合成抑制剂放线菌酮（CHX）处理NRCMs,使用Western Blot实验检测PARP1及其上下游蛋白的表达情况,明确PARP1是否经溶酶体降解。（2）通过Co-IP和免疫荧光共聚焦验证PARP1和Hsc70是否存在相互作用。2、明确CMA调控PARP1的具体机制:（1）通过构建LAMP2A基因过表达和干扰腺病毒载体来激活或抑制CMA,通过Western Blot检测PARP1及其上下游蛋白PAR和AIF的蛋白表达。（2）Western Blot检测激活或抑制CMA后,再利用自噬激活剂EBSS和自噬阻断剂CQ进一步验证PARP1是否经CMA途径降解。3、探究氧化应激损伤状态下,CMA对PARP1的调控作用:（1）利用H2O2构建细胞氧化应激损伤模型,通过TUNEL实验检测细胞凋亡情况。（2）利用Western Blot检测细胞应激损伤程度与蛋白表达量之间的关系。（3）利用免疫荧光共聚焦实验探究H2O2刺激后PARP1和Hsc70共定位的变化情况。研究结果:1.PARP1经溶酶体途径降解。NRCMs经使用自噬激活剂EBSS后,Western Blot结果显示PARP1蛋白表达水平逐渐降低,而经EBSS与自噬阻断剂CQ同时处理后,PARP1蛋白下降程度明显缓解。此外,NRCMs经线菌酮CHX抑制蛋白合成后,PARP1蛋白表达水平下降,而与CQ同时处理后,CQ也可显著缓解CHX导致的PARP1蛋白表达下降。2.PARP1与Hsc70存在相互作用。采用免疫共沉淀与免疫荧光共聚焦验证PARP1与Hsc70存在相互作用。PARP1基因的氨基酸序列符合“KFERQ”五肽基序特征,氨基酸序列位于353-357和670-674。3.PARP1在心肌细胞中经CMA途径降解。NRCMs经EBSS处理激活自噬后,Western Blot结果显示PARP1的上游蛋白PAR及下游蛋白AIF也呈下降趋势;利用巨自噬抑制剂3-MA和EBSS同时处理后,结果显示3-MA对PARP表达的影响不明显。此外,抑制CMA会导致PARP1及其上下游蛋白表达上升,且该趋势可以被自噬激活剂EBSS所逆转。反之,激活CMA导致PARP1及其上下游蛋白表达下降,并且该下降趋势可被自噬阻断剂CQ逆转。4.CMA可以通过抑制PARP1（cleaved）的蛋白表达来保护心肌细胞免受氧化应激所致的凋亡。4.1激活CMA可以抑制氧化应激导致的细胞凋亡TUNEL实验结果显示,H2O2刺激可导致细胞凋亡且呈浓度依赖性;激活CMA可有效抑制细胞凋亡。反之,抑制CMA则促进细胞凋亡。4.2激活CMA影响PARP1（cleaved）的蛋白表达Western Blot结果显示低浓度的H2O2可激活CMA,LAMP2A蛋白表达升高,PARP1（cleaved）的表达下降;而高浓度H2O2（>400?M）使CMA功能严重受损,导致细胞内的LAMP2A表达下降,而PARP1（cleaved）表达显著升高。此外,Western Blot结果显示激活CMA可以降低PARP1（full length）及PARP1（cleaved）的蛋白表达,并缓解了H2O2刺激导致的PARP1（cleaved）表达升高;反之,抑制CMA活性后,PARP1（full length）与PARP1（cleaved）表达均升高,同时也使H2O2刺激后PARP1（cleaved）的上升趋势更为显著。免疫荧光共聚焦实验发现,细胞受到H2O2刺激后PARP1与Hsc70之间的共定位发生明显改变,大部分PARP1从细胞核转移到细胞浆中,且与Hsc70共定位呈现升高趋势。研究结论:1、PARP1与Hsc70存在相互作用,PARP1是CMA的底物蛋白。2、PARP1在心肌细胞中经CMA途径降解。3、CMA通过抑制PARP1（cleaved）蛋白表达,抑制氧化应激导致的心肌细胞凋亡。