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目的肝脏是外源性化合物代谢的主要场所,也是化学品及其代谢产物毒作用的重要靶器官。对来自体内和体外的许多物质如药物、毒物以及体内某些代谢产物,肝脏可通过新陈代谢将它们彻底分解或以原形形式排出体外。据估计,超过1100种常用的化学药物、草药、天然产品、维生素、矿物质和膳食补充剂具有潜在的肝毒性。化学性肝病种类繁多,其中药物性肝损伤是最常见的急性肝衰竭原因,给世界各地的医疗系统造成巨大的经济负担。因此,需要对化学品的肝毒性进行及时准确的评估以避免对人体造成危害。然而,化学品风险评估仍存在许多困难和障碍。例如,由于参与药物吸收、分布、代谢、排泄的肝脏蛋白和酶的表达及催化活性存在物种差异,动物模型不能准确复制人类肝损伤的病因和发病机制;二维（Two-dimentional,2D）细胞体外模型相比于以动物为载体的传统毒性测试有高通量、廉价等优势,但仍存在缺乏代谢酶活性和有限的生长活性等问题。因此,建立能够模拟人体肝细胞的体外模型,对体外化学性肝损伤评估有重大意义。越来越多人肝细胞来源的体外系统已经被开发并应用于预测化学性肝损伤的风险。三维（Three-dimentional,3D）体外模型是进行毒性试验和安全性评价的新兴工具,相比于传统2D细胞可以更好的模拟人体的内环境和组织功能。Hepa RG细胞被视为人原代肝细胞（Primary human hepatocytes,PHH）的替代物,近年来广泛应用于肝脏疾病的探究和药物肝毒性的评估。故本研究拟利用Hepa RG细胞系建立3D肝细胞模型,并比较2D细胞与3D细胞在代谢功能上的差异;应用建立的模型对肝毒性药物对乙酰氨基酚（Acetaminophen,APAP）和曲格列酮（Troglitazone,TRO）所诱导的肝毒性进行评价;根据肝毒性评价结果选择合适的体外模型,应用该模型对蓖麻毒素和相思子毒素进行安全性评估并探究其毒性机制。方法1.采用低吸附法构建3D Hepa RG细胞模型,以1000、2000、6000/孔的密度接种于96孔板,在接种后第1、3、7、10、14天分别记录细胞形态学变化并利用P450-Glo试剂和蛋白质印记法（Western blotting,WB）比较2D/3D Hepa RG细胞CYP3A4酶活力和蛋白表达差异;2.2D/3D Hepa RG细胞给予APAP（0.16、0.8、4、20 m M）,应用Alamar blue法测定细胞存活率,高内涵成像分析检测线粒体活性氧自由基（Reactive oxygen species,ROS）、线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential,MMP）和线粒体丰度,比较APAP引起的肝细胞损伤;通过液相质谱法（Liquid chromatography–mass spectrometry,LC-MS）检测2D/3D Hepa RG细胞中APAP的代谢产物,并进行比较;3.3D Hepa RG细胞给予TRO（3.125,6.25,12.5,25,50μM）处理不同时间后,应用Alamar blue法测定细胞存活率,检测线粒体ROS、MMP和线粒体丰度;4.给予3D Hepa RG细胞蓖麻毒素和相思子毒素（1.25、2.5、5、10和20 ng/m L）,处理后,测定细胞存活率,并检测线粒体ROS和线粒体丰度。结果1.采用低吸附法构建了3D Hepa RG模型,在第3天时,细胞自发聚集形成致密的球形。以1000、2000、6000/孔的接种密度分别进行接种,在第7天时分别形成直径约为180、250和300μm的球体细胞,其直径大小和形态稳定;2.在第7天时,对比2D Hepa RG细胞和3D Hepa RG细胞CYP3A4酶活力和表达差异,发现3D Hepa RG细胞比2D细胞表现出更高CYP3A4活性和表达,提示3D Hepa RG细胞比2D细胞具有更强的代谢能力;3.APAP在2D和3D Hepa RG细胞中的细胞存活率均呈剂量依赖性下降,但3D Hepa RG细胞在更低剂量（0.8 m M）下表现出细胞毒性;APAP诱导2D和3D培养的Hepa RG细胞表现出线粒体ROS累积和MMP丧失,并且3D培养的细胞对APAP诱导的线粒体氧化应激和功能障碍的敏感性比2D培养的细胞更高,提示线粒体相关指标可以作为3D培养的Hepa RG细胞的毒性敏感生物标志物;3D Hepa RG细胞比2DHepa RG细胞产生更多的APAP-GSH和APAP-硫酸盐（APAP-sulfate）,亦提示3D Hepa RG细胞具有更强的代谢能力;4.通过PBPK模型预测APAP口服中毒剂量下人体肝脏组织中APAP浓度为1.19 m M,比较2D和3D细胞中评估的线粒体毒性生物标志物在体外的最低显著毒性浓度,发现3D细胞模型比2D细胞模型更接近PBPK预测值,提示3D细胞模型更敏感且更接近人体肝脏浓度,说明3D细胞模型更适合用于化学性肝损伤评估;5.TRO可剂量依赖性地降低3D Hepa RG细胞的存活率,应用高内涵成像分析检测其诱导的线粒体损伤,发现3D Hepa RG细胞表现为线粒体ROS生成增加,MMP和线粒体丰度下降;6.蓖麻毒素可剂量依赖性地降低3D Hepa RG细胞的存活率,IC50值为21.98ng/m L,并引起3D Hepa RG线粒体ROS升高,10 ng/m L时为对照组的148%;7.相思子可剂量依赖性地降低3D Hepa RG细胞的存活率,IC50值为8.73ng/m L,并引起3D Hepa RG线粒体ROS升高,在2.5 ng/m L、10 ng/m L时分别升高至对照组的112%和150%。结论1.采用低吸附法成功构建了3D Hepa RG模型,其代谢酶表达和活力均比2D Hepa RG细胞更具优势,更能准确地对化学性肝损伤进行评估,表明3D Hepa RG模型在评估药物性肝损伤等肝毒性测试中具有潜在的重要应用价值;2.蓖麻毒素和相思子毒素对3D Hepa RG细胞的细胞毒性和线粒体毒性呈明显剂量依赖性,线粒体损伤可能是蓖麻毒素和相思子毒素致肝细胞毒性的关键事件。