背景及目的:急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是临床上常见的急腹症之一,其发病率高、临床病理变化复杂,尤其是重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)并发全身炎症反应综合征( systemic inflammatory response syndrome,SIRS)和多器官功能衰竭(multiple system organ failure,MSOF)时,病情发展快,死亡率高。SAP的主要病理特征为胰腺组织大范围出血性坏死,并可迅速累及邻近周围组织。临床上大多数予以禁食、胃肠减压、补充血容量、改善微循环、维持水电解质平衡、血液透析、镇静、解痉、抑制胰酶分泌、激素及抗生素应用、外科手术、中药、营养支持等综合治疗方法,尽管近几年SAP病死率和并发症有所下降,但目前的治疗均缺乏特异有效性,很难完全逆转病情的发展,治疗效果都不甚理想。骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)具有取材方便、创伤性小、低免疫原性、可在体外大量培养扩增等特点。近来国内外研究表明BMSCs可通过分泌一系列细胞因子和调节蛋白以对抗细胞凋亡、器官纤维化和炎症反应,其免疫调节作用也表现在能够上调具有抑制性免疫调节功能的CD4~+CD25~+调节性T细胞,从而对受损组织器官发挥保护和修复及控制炎症反应的功能。通过观察同种异体BMSCs移植对SAP模型大鼠外周血CD4~+CD25~+调节性T细胞及炎症因子的影响,证实BMSCs在SAP时对抗炎症反应、保护和修复受损胰腺组织的重要作用,为BMSCs在SAP的临床治疗应用提供实验依据。同时对SAP模型大鼠进行中西医结合治疗研究,有助于为临床遏制急性胰腺炎病程进展,降低SAP死亡率提供新的治疗思路。方法:通过Percoll密度梯度离心法与全骨髓贴壁分离法分离、培养BMSCs,获得第3代细胞。通过流式细胞术检测细胞表面标志CD45、CD90,同时应用成骨、成脂肪样细胞诱导分化方法鉴定所获得的BMSCs。经十二指肠乳头逆行胆胰管注入1.5﹪脱氧胆酸钠溶液的方法制备SAP大鼠模型。将健康SD大鼠随机分为5组,即假手术组(SO),模型组(SAP),骨髓间充质干细胞(BMSCs)治疗组、大承气汤(ZY)治疗组、中西医结合(ZXY)治疗组,每组12只。BMSCs组采用同种异体BMSCs经尾静脉注射移植治疗;ZY组采用大承气汤灌胃治疗;ZXY组采用两种治疗方法并用。通过DAPI标记BMSCs体内示踪、测定血清炎症因子IL-6与IL-10含量、测定血清淀粉酶与脂肪酶含量、观察胰腺大体解剖与组织病理学切片、流式细胞术测定外周血CD4~+CD25~+T细胞比率等方法,分析BMSCs及中西医结合方法对SAP大鼠的治疗作用并初步探讨其机制。结果:1.BMSCs呈纺锤形、三角形、多角形等形态,增殖快的细胞趋向集落样生长,经过传代培养,细胞形态逐渐均一,组份逐渐得到纯化;流式细胞术检测显示,BMSCs细胞表面CD90呈阳性表达约91.39﹪,CD45呈阴性表达约99.72﹪;经成骨诱导分化后茜素红染色阳性;成脂诱导分化后油红O染色阳性。2.模型组大鼠术后24h,开腹可见胰腺肿大,出血坏死表现,腹腔内有大量血性腹水,大网膜处见有浅黄色皂化斑。组织病理学切片见胰腺实质大片出血,凝固性坏死,小叶结构模糊不清,胰腺组织间隙及实质内有大量中性粒细胞及单核细胞浸润。各治疗组的各项指标变化程度均明显轻于模型组,其中ZXY组病变程度最轻。3.(1)DAPI标记的BMSCs体内示踪:荧光显微镜下可见BMSCs组胰腺冰冻切片管腔组织中有明亮蓝色荧光细胞,SAP组大鼠观察不到有明亮蓝色荧光的细胞。提示BMSCs在SAP模型大鼠中能定位于受损胰腺组织。(2)血清淀粉酶与脂肪酶含量,SAP组较SO组均显著升高(P﹤0.01);各治疗组较SAP组均显著性下降,且ZXY组下降水平最明显(P﹤0.01)。(3)SAP组大鼠血清炎症介质IL-6水平较SO组显著升高(P﹤0.01),各治疗组IL-6水平较SAP组均显著下降,且ZXY组下降水平最明显(P﹤0.01)。SAP组及各治疗组大鼠血清炎症介质IL-10水平较SO组均显著升高(P﹤0.01),BMSCs组与ZXY组IL-10水平较SAP组均明显升高(P﹤0.05),ZY组IL-10水平较SAP组变化不明显,差异无统计学意义(P﹥0.05)。(4)大鼠血清CD4~+CD25~+T细胞百分率,SAP组较SO组显著下降(P﹤0.01),ZY组较SAP组有所升高,但差异无统计学意义(P﹥0.05),BMSCs组及ZXY组较SAP组均明显升高(P﹤0.05)。结论:1.建立了良好的BMSCs分离、培养及鉴定方法,获得的第3代以后的BMSCs成均一的纺锤形,纯度达到90﹪以上;流式细胞术检测细胞表面标志以及成骨、成脂肪样细胞诱导分化均证实所获得的细胞符合BMSCs特性。2.通过BMSCs移植与中药大承气汤治疗,减轻了SAP模型大鼠炎症、腹水、出血坏死等病变情况,降低了血清淀粉酶、脂肪酶与炎症介质IL-6的含量,与SAP组比较,各治疗组抗炎细胞因子IL-10有不同程度提高,大鼠死亡率都明显降低。通过DAPI标记BMSCs体内示踪实验表明BMSCs能通过血循环迁移至胰腺炎受损部位,从而参与胰腺受损组织保护与对抗胰腺炎症反应。SAP组外周血CD4~+CD25~+T细胞百分率较SO组显著下降,BMSCs移植治疗后,外周血CD4~+CD25~+T细胞百分率明显提高,提示CD4~+CD25~+T细胞可能参与了BMSCs对抗炎症反应的过程。各治疗组相比较中西医联合用药组病理改善最明显,各项检测指标最优,因此BMSCs与中药联合用药可能通过提高外周血CD4~+CD25~+T细胞百分率对抗炎症反应,遏制SAP病情发展,改善预后,是治疗SAP的有效方法