[研究背景]百草枯(PQ)农药在我国农业生产中应用较广,误服或口服中毒可造成严重不良后果。经口摄入中毒为其最常见的中毒方式及途径,也可通过包括气道和皮肤粘膜在内的多种途径吸收。国内外文献中关于急性百草枯中毒(Acute paraquat poisoning,APP)患者死亡率的报道跨度较大,多数认为50%以上。急性百草枯中毒患者早期可仅表现为口咽部及食道的局部腐蚀损伤,甚至无症状,而后部分患者病情迅速进展,于数小时或数日内死亡,仅有小部分患者在度过急性期后可存活。当前对急性百草枯中毒患者的临床救治实践中,由于没有专用解毒剂,尚未能找到有效治疗方法,人中毒后多发生死亡。百草枯经消化道吸收入血后,可随循环向全身分布,造成肺脏等全身多个脏器功能损害。因预后不良,目前百草枯中毒己引起世界各国广泛关注。百草枯血药浓度检测对急性百草枯中毒患者的病情评判、治疗均具有很大价值,但目前尚无满意的PQ血药浓度快速检测方法。现有检测方法操作步骤繁多,在临床实践中应用受限。因此在百草枯血药浓度检测方面确立一种专属性强、敏感快速的方法,可以为评估患者中毒程度,评判预后,检验临床各种治疗方案的效果提供支持。准确的判断百草枯中毒预后可以避免对那些毫无希望或轻微中毒的患者进行不恰当的过度医疗,节约医疗资源,减轻患者负担。百草枯损害主要发生于肺部,其机理可能是通过诱导氧化-还原反应并持续产生氧自由基。氧化剂可诱导多种早期反应基因的活化表达并激活相应转录因子,最终导致炎性反应。体内外实验表明,除肺损伤外,百草枯还可对大脑、心脏、肾脏、胰腺及肝脏等多个脏器造成损害。目前对于百草枯预后判断尚无统一的标准,导致在制定治疗方案时有一定盲目性,对于糖皮质激素(甲强龙)、血液净化、及免疫抑制剂(环磷酰胺)的使用时机及剂量缺乏准确的把握,对于轻症患者可能存在过度医疗,而对于重症患者则无有效作用。本研究试图通过对急性百草枯中毒患者服毒情况以及初始入院时采集的多项检测结果进行分析,以探讨影响急性百草枯中毒患者预后的主要因素。百草枯中毒损伤机制尚不明确,有研究提出细胞因子(CK)网络的失衡是百草枯中毒引起肺损伤的重要因素。因此尽早清除血液中的百草枯及过度表达的细胞因子是治疗成功的关键,探索新的清除毒物方案是临床药物中毒救治工作的重点之一。血液灌流(HP)可以吸附清除患者血中的PQ毒素,在急性百草枯中毒患者的救治中应用比较广泛,但疗效尚未达到满意效果。而血液滤过常应用于急性重症胰腺炎、脓毒症、循环不稳定的肾功能衰竭、多器官功能障碍综合征等急危重症,它具有高效清除体液中炎性因子、调节免疫系统、改善组织氧合、对循环影响小、减低容量负荷等作用。在本研究中,通过检测急性百草枯中毒患者血液灌流前后血浆百草枯药物浓度变化以及序贯连续静脉-静脉血液滤过前后血清细胞因子浓度变化,研究血液灌流序贯连续性静脉-静脉血液滤过(HP+CWH)治疗在急性百草枯中毒中的疗效及其对预后的影响。[实验方法]1.研究对象及分组选取2014.06～2015.05因口服百草枯中毒就诊于滨州医学院附属医院急诊科的患者,服毒时间小于24小时,年龄18岁～70岁。本研究采取两项分组方案。方案一 以死亡或2月内随访仍存活为观察终点,将患者分别归入死亡组和存活组。记录患者入院时的服药剂量,PQ血药浓度,肝功指标：直接胆红素(DBIL)、间接胆红素(IBIL)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST),肾功指标：血尿素氮(BUN)、肌酐(CREA),淀粉酶(AMY),肌酸激酶同工酶(CK-MB),血常规：外周血白细胞计数(WBC)、包括中性粒细胞比例(N%)。比较两组一般情况、服药剂量、入院时PQ血药浓度、肝功指标、肾功、淀粉酶、心肌酶及白细胞指标情况。采用Logistic回归研究上述参数对急性百草枯中毒患者生存率判定的价值。方案二 依据所接受治疗方案不同将患者分别归入对照组和血液净化组：对照组只接受洗胃、导泻及抗氧化药物等内科常规治疗；血液净化组在上述治疗同时还接受HP+CVVH治疗,暨患者入院后1小时内开始进行血液灌流治疗,持续时间2小时,血液灌流完成后立即序贯给予血液滤过治疗,持续约48小时。对照组测定患者刚入院时、入院后3h、入院后51h的PQ血药浓度、转化生长因子-β(TGF-p).肿瘤坏死因子-α[(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)浓度。血液净化组于患者刚入院时、血液灌流治疗后(3h)、血液滤过治疗后(51h)测定上述指标。比较两组患者分别经一般治疗、血液灌流干预后的PQ血药浓度水平；比较两组患者分别经一般治疗、HP+CVVH干预后的血浆IL-1、TNF-α、TGF-β水平；比较血液净化组患者进行血液灌流前后PQ血药浓度的变化；比较血液净化组患者进行血液滤过前后血浆IL-1/TNF-α/TGF-β水平；比较两组患者的总体死亡率及两组中死亡患者的生存时间。2.确立急性百草枯中毒患者PQ血药浓度测定条件及方法向血液样品内预先滴入高氯酸(35%)以沉淀杂质蛋白。流动相为0.1mol· L-1磷酸缓冲液：乙腈(88：12,三乙胺调pH=3.0)；离子对试剂为75mmol·L-1 1-庚烷磺酸钠；流速选择1.0 mL.min-1;柱温选择28℃;检测波长选择258 nm。检测该色谱条件下方法专属性,建立标准曲线,检测相对回收率和绝对回收率、日内以及日间精密度,并进行稳定性试验。3.死亡患者肺脏组织和肝脏组织形态学分析对部分死亡患者死亡后提取肺、肝脏标本,行常规HE染色分析。4.血浆细胞因子检测应用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附技术(ELASA),检测急性百草枯中毒患者血浆IL-1、TNF-α、TGF-β水平。[实验结果]1.急性百草枯中毒患者PQ血药浓度测定方法：在本研究设定的色谱条件下,血浆中百草枯峰与血浆内杂质峰可以完全分离,不受干扰。百草枯的峰形形成良好。百草枯保留时间为6-9分钟,专属性较好。百草枯血药浓度的标准曲线回归方程为y=0.000011x-0.9956,r=0.998,y为百草枯浓度(μg·mL),x为峰面积。在0.2～500 μg·mL-1范围内呈线性关系。最低检出限(S/N=3)可达0.1μg·mL-1。绝对回收率平均为100.6%,RSD值小于3%。相对回收率平均为101.3%,RSD值小于6%。日内和日间精密度RSD值均小于6%。在本实验条件下,对百草枯样品冻存不同时间及多次冻融后进行浓度测定结果稳定。2.初始临床数据对急性百草枯中毒患者预后的价值：统计分析表明,存活组患者服药剂量明显少于死亡组(32.50±14.07ml VS 118.27±141.90ml),入院时PQ血药浓度明显低于死亡组(7.26±4.52 mg/L VS 17.72±7.53mg/L)。存活组患者入院时肝功指标中ALT、AST、DBIL水平明显低于死亡组,而IBIL水平与死亡组相比无明显差异。存活组患者入院时肾功指标中的BUN、CREA及AMY、CK-MB水平明显低于死亡组。存活组患者入院时血常规指标中的WBC计数明显低于死亡组,N%水平两组无显著差异,其中存活组WBC计数及N%分别为(9.13±1.71)×109/,L和(82.59±7.47)%,而死亡组分别为(21.98±9.00)×109/L和(85.55±10.47)%。Logistic回归分析发现PQ血药浓度与患者生存率密切相关。3.急性百草枯中毒患者肺组织损伤形态学表现：肺损伤形态学改变具有以下特点,早期是毁损期,肺泡上皮损害；镜下可见部分区域的肺泡间隔存在断裂、融合,部分区域的肺泡间隔增宽,肺泡腔内可以见到少许渗出物及红细胞。4.血液净化治疗干预下急性百草枯中毒患者血药浓度、炎症指标变化及与预后相关性：血液净化组与对照组比较,刚入院时两组患者PQ血药浓度及血浆细胞因子水平(IL-1、TNF-α、TGF-β)无明显差异。入院3小时,血液净化组经血液灌流治疗干预后,患者PQ血药浓度明显降低。入院51h,即血液滤过后两组相比较,血液净化组患者血浆三种细胞因子IL-1、TNF-α、TGF-β的水平均明显低于对照组。行血液灌流治疗后患者PQ血药浓度由刚入院时的(15.27±9.08)mg/L降至(3.37±1.9)mg/L。行序贯血液滤过治疗后,患者血浆IL-1、TNF-α、TGF-β水平均明显降低。血液净化组死亡病例平均生存时间较对照组显著延长,但两组在总体死亡率方面对比无明显差异。[结论]1.应用高效液相色谱法(HPLC)测定患者的PQ血药浓度,百草枯的峰形形成良好,且有恰当的保留时间。切合方法学对精密度和回收率的要求,且分析过程易于掌握,可在30分钟以内完成检测。HPLC可应用于临床急性百草枯中毒患者的PQ血药浓度快速检测,对判断临床病情、指导治疗及评估预后都具有重要的价值。2.存活组患者服药剂量少于死亡组,存活组患者入院时血浆ALT、AST、DBIL, BUN、CREA、AMY、CK-MB水平和WBC计数明显低于死亡组；而IBIL及N%水平两组间比较无明显差异。Logistic回归分析发现PQ血药浓度与患者生存率密切相关。肺损伤形态学改变具有以下特点,早期是毁损期,肺泡上皮损害；镜下可见部分区域的肺泡间隔存在断裂、融合,部分区域的肺泡间隔有增宽,肺泡腔内可以见到少许渗出物及红细胞。百草枯血药浓度是急性百草枯患者能否存活的关键影响因素,初始临床数据可初步评估急性百草枯中毒患者的病情轻重,协助预测预后。3.HP+CVVH治疗可明显减低急性百草枯中毒患者PQ血药浓度,并可显著降低血浆IL-1、TNF-α TGF-β等细胞因子的水平,HP+CVVH治疗对急性百草枯中毒具有一定疗效,使中毒患者的生存时间具有延长趋势。本研究显示HP+CVVH治疗未能降低急性百草枯中毒患者的死亡率。