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MicroRNAs(miRNAs)是目前研究较多的一类存在于真核生物体内的长20~24nt的内源性的单链小分子RNA。主要在转录后水平对基因进行表达调控,广泛参与植物生长发育过程。已有研究显示,一些特定的miRNA参与植物花药发育过程,是导致花药发育异常、产生雄性不育的重要原因之一。目前有关miRNA在植物花药发育中的研究报道主要集中于水稻、玉米、棉花、油菜等作物,在小麦上的研究报道不多,研究小麦花药发育过程中起作用的特定miRNA对小麦雄性不育与杂种优势利用研究有重要意义。本实验室前期以小麦光温敏雄性不育系337S在短日低温不育和正常可育条件下的花药为材料,通过RNA测序分析鉴定出了一些在小麦337S花药发育中差异表达显著的miRNAs。本研究以miR1127b、miR9652、miR2275为候选基因,构建出过表达载体在不同小麦愈伤中进行遗传转化。由于前期降解组测序时没有找到miR1127b、miR9652的靶基因,仅miR2275找到了其靶基因CAF1,故对CAF1基因进行了同源克隆,对miR2275基因进行了遗传转化研究,以期初步了解miR2275与靶基因CAF1在小麦生殖发育中作用。主要研究结果如下:1.miR2275、miR9652、miR1127b基因的遗传转化:借助于Gateway技术,构建了miR2275、miR9652、miR1127b基因的过表达载体,并通过农杆菌介导法和基因枪法转化不同小麦品种。转基因植株经初步PCR检测,基因枪介导的小麦幼胚遗传转化,miR2275基因转化共得到阳性苗18株,华麦2566阳性苗10株,Bobwhite7株,337S阳性苗1株,阳性率分别为1.94%、1.51%、0.23%。农杆菌介导小麦幼胚的遗传转化,miR1127b基因转化只有华麦2566得到1株阳性苗,阳性率为0.19%;miR9652基因转化只有Bobwhite得到1株阳性苗,阳性率为0.19%;miR2275基因转化共得到3株阳性苗,受体均为华麦2566,阳性率为0.99%。2.miR2275靶基因CAF1的同源克隆:前期研究对337S花药进行了降解组测序,仅miR2275找到了其靶基因CAF1。利用同源克隆方法克隆出了CAF1的6个同源基因,分别命名为CAF1-3A-1、CAF1-3A-2、CAF1-3B-1、CAF1-3B-2、CAF1-3D-1、CAF1-3D-2。生物信息学分析发现,除了CAF1-3B-2,另外5个基因均含有CAF1家族的高度保守结构域。其中CAF1-3A-1与CAF1-3A-2基因间同源性较高。CAF1-3B-2存在34bp的缺失,产生终止密码子,造成翻译的提前终止。只有CAF1-3D-1蛋白存在一个跨膜区域,CAF1-3B-1与CAF1-3D-2为疏水性蛋白,其余均为亲水性蛋白。3.靶基因CAF1的亚细胞定位与表达:分别构建了GFP与CAF1-3A-1、CAF1-3B-1、CAF1-3D-1、CAF1-3D-2的N端和C端融合的亚细胞定位载体,并在本氏烟草中进行了瞬时表达。定位结果显示,GFP与N端融合的蛋白在烟草细胞核、细胞膜或细胞壁中均出现绿色荧光,表明这4个蛋白均在细胞核、细胞膜或细胞壁中表达。另外构建了CAF1-3A-1、CAF1-3D-1、CAF1-3D-2的原核表达载体,并在BL21(DE3)大肠杆菌菌株中初步确定了适宜的表达条件,即在18℃、0.5mM IPTG下诱导12h均能使这3个蛋白表达。4.靶基因CAF1启动子基因的克隆:克隆了CAF1的6个启动子基因,构建了启动子驱动的GUS融合蛋白表达载体并通过农杆菌介导的花序侵染法转化野生型拟南芥,获得了相应的转基因植株。5.小麦转基因阳性苗的表型:对小麦转基因阳性苗的表型观察发现,与野生型材料华麦2566、华麦2152、Bobwhite、337S相比,转miR2275基因的阳性苗出现不结实和部分结实的现象。其中Bobwhite的1株阳性苗长势较弱,植株矮小,没有结实。337S的1株阳性苗从穗中部开始往上均表现出比野生型植株开颖角度大,雌蕊外露,仅穗基部有少量结实。这进一步显示,miR2275是决定337S不育性的重要因子之一。