蛋白酶主要来源于微生物、动植物,可催化蛋白质和多肽的肽键水解,使其降解为小分子的多肽或氨基酸等物质。通过控制蛋白质酶解过程制备功能性肽、功能性蛋白和风味基料是实现其资源高值化利用的重要途径。随着酶解技术的成熟和蛋白质控制酶解产业的高速发展,迫切需求开发新型特异性蛋白酶。蛋白酶在水产蛋白酶解过程中应用普遍,但并非所有的蛋白酶都适合于水产蛋白,不同的蛋白酶对相同底物的水解能力差异很大。因此,选择适宜的蛋白酶应用于水产蛋白酶解至关重要,目前常用的商品蛋白酶主要有木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、陆生微生物蛋白酶,但海洋来源蛋白酶在水产蛋白加工中的应用研究较少。微生物源蛋白酶不受资源、空间和环境的限制,而且大多为外源酶,拥有比动植物来源蛋白酶更大的优越性。相比陆生微生物蛋白酶,海洋源微生物蛋白酶应用于水产蛋白加工中可能具有近源性优点,对水产蛋白有更好的水解效果,使酶解产物具有不同的风味和功能特性。为开发海洋来源微生物蛋白酶,本文以海水养殖凡纳滨对虾肠道为研究对象,通过2216E培养基对肠道微生物进行分离纯化,利用蛋白酶水解圈法初筛得到26株产蛋白酶菌株,测定菌株的透明圈直径与菌落直径比值(即D/d)初步估计其产酶能力,通过测定发酵液酶活力复筛得到一株高产蛋白酶菌株,编号为LVi-6,通过形态学观察、生理生化鉴定、16S rDNA基因序列分析及系统发育树分析进行菌种鉴定,为鳗弧菌(Vibrio anguillarum)。发酵粗蛋白酶液经硫酸铵分级盐析、Q-FF阴离子交换层析、S-100凝胶过滤层析后,SDS-PAGE凝胶电泳呈单条带,达到电泳纯级,比活力从4035.11 U/mg提高到10925.27 U/mg,是初始的2.71倍,得率为47.03%。酶学性质研究表明其最适反应温度为50℃,最适反应pH值为7.5,为中温中性蛋白酶。蛋白酶在40℃以下热稳定性较好,在60℃以上易失活,在pH 6~8范围内pH稳定性较好。Zn2+对蛋白酶有一定的激活作用,Co2+对蛋白酶有较强的激活作用;Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Fe2+对酶活力作用不明显;Cu2+、Hg+对该蛋白酶活力有较强的抑制作用,其中Hg+的抑制作用尤其强烈。EDTA对该蛋白酶有强烈的抑制作用,该蛋白酶是一种金属蛋白酶。以酪素为底物,当其浓度达到28 g/L时酶活性达到最大;其动力学参数Km和Vmax值分别为8.99 g/L和5.90μg/(mL?min)。分别选用修饰剂DTNB、NBS、BrAc、乙酰丙酮、PMSF、甲醛对蛋白酶进行修饰,结果表明该蛋白酶的巯基、组氨酸残基、精氨酸残基、丝氨酸残基与酶活性不直接相关,不是该蛋白酶活性中心的必需基团;氨基和色氨酸残基是该蛋白酶发挥活性的必需基团;经NBS修饰后蛋白酶在278 nm的特征吸收峰没有发生变化表明其三级结构没有被破坏。分别采用MALDI-TOF/TOF-MS、LC/MS/MS质谱及Edman降解N-端氨基酸测序3种方法对该蛋白酶进行鉴定。通过生物信息学分析得知其分子量为66725.61Dal,等电点为5.86,由611个氨基酸组成,其中疏水性氨基酸196个,极性氨基酸146个。Blast同源性分析得知该蛋白酶与Vibrio anguillarum金属蛋白酶同源性达到99%,说明该蛋白酶有Vibrio anguillarum蛋白酶的序列结构特征及相似功能。对Vibrio anguillarum金属蛋白酶进行同源建模和结构预测得知该蛋白酶在中心凹陷位置有一保守区域,该区域是其和锌离子结合的活性位点,而酶学性质研究推测其活性中心应有Zn2+结合位点的存在,两者结果吻合,表明该建模具有较高的理论价值和实际意义。为评估该蛋白酶的酶解特性,以酪蛋白作底物,对比该蛋白酶与商品蛋白酶的水解度、酶解液游离氨基酸含量及分子量分布差异,得知该蛋白酶对酪蛋白的水解度较高且酶解液游离氨基酸含量也较高,分子量在1000~5000Da和小于500Da范围的含量高于其他蛋白酶。以虾蛋白作底物,对比Vibrio anguillarum蛋白酶与中性蛋白的水解度、酶解液的游离氨基酸含量及DPPH自由基清除率得知该蛋白酶优于中性蛋白酶对虾蛋白的酶解效果。