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在酶的固定化技术中,共价连接因连接牢固可以避免酶在使用时从载体中泄漏,并可显著增强酶的刚性和稳定性。然而,传统共价连接多依赖组成酶蛋白的侧链氨基如赖氨酸,连接位点选择盲目以及连接反应随机进行,酶活性中心多因此遭掩埋或破坏而致固定化后酶活性大幅下降,无疑增加了酶生物催化的成本。因此如何突破传统共价连接技术中的此类缺陷,实现高效及位点特异性的精准固定化变得十分重要。首先,为了避免载体与酶蛋白间的随机化学连接和固定,使用掺入的非天然氨基酸（NSAAs）修饰改造酶,再通过点击化学反应获得固定化酶蛋白。为此,将醛酮还原酶（AKR）用作模板酶,并将110Y,114Y,143Y,162Q和189Q分别替换为对叠氮-L-苯丙氨酸（p Az F）。然后,通过应变促进炔烃-叠氮化物环加成反应（SPAAC）将AKR突变体交联到环辛炔功能化载体上。并研究了非天然氨基酸（NSAAs）的掺入数量和位点对固定化AKR的固定化率和热稳定性的影响。结果表明,突变型普遍的比野生型具有更好的比活性,而AKR-114Y的活性比野生型高1.16倍。而且,五点固定化AKR的半衰期(t1/2)在30℃和60℃下分别达到106 h和45 h,分别是游离酶的13倍和7倍。对这三种不同数量位点（单点,三点和五点）酶突变体的比较表明,位点选择对固定化酶的活性具有重要的影响作用,偏离活性中心的生物正交化学连接可有效保护酶蛋白的活性,并可实现同步纯化,多点固定化亦可提高负载量和热稳定性。其次,为了实现绿色的、无载体固定化,基于以上多点精准固定化的基础,探索制备快速和精准的生物正交交联酶（Rapidly and Precisely Crosslinked enzymes,RP-CLEs）的方法。使用非天然氨基酸（NSAAs）多点掺入修饰改造酶蛋白,在微波辅助辐射下,利用无铜点击反应制备酶交联聚集体。为此,使用上述AKR多点突变体,加入环辛双炔（sym-dibenzo-1,5-cyclooctadiene-3,7-diyne）通过环加成反应（SPAAC）实现酶分子间交联,并研究了AKR碱基序列中突变位点的位置和数目对固定化率和热稳定性的影响。在10℃的微波辐射下4分钟,多点AKR突变体发生交联,其中五点突变体的固定化率可以达到90%,从而由细胞裂解液上清液直接制备得到生物正交交联酶（RP-CLEs）。该RP-CLEs的比酶活为2.06 U·mg-1,约为游离AKR五点突变体的2倍。在微波辐射下制备的RP-CLEs还具有增强的热稳定性,其在60℃下的半衰期(t1/2)为26.76 h,约为AKR五点突变体的4.5倍(t1/2)当RP-CLEs也可用于催化克唑替尼中间体（S）-2,6-二氯-3-氟苯乙醇的手性合成时,产品产率可达90%,ee值（enantiomeric excess）超过99%。批次催化反应中在每轮反应12 h的循环中催化6轮后,RP-CLEs催化合成时目标产物的产率仍可达到初始批次的80%。结果表明,基于酶结构的分析,可以合理地将不同数目的NSAAs掺入序列中,且借此精准地指导和控制目标酶的共价交联,非修饰酶却因未掺入非天然氨基酸而无法交联故被高浓度洗涤液洗脱,制得生物正交交联酶聚集体,并实现目标酶蛋白的精准交联与同步纯化。总之,本文通过掺入了多点非天然氨基酸的醛酮还原酶进行酶固定化研究,确定了一种新型的、可精准定位的固定化酶方法。并在此基础上,开发了一种快速、精准的生物正交交联酶（RP-CLEs）。该交联酶在催化生成克唑替尼中间体（S）-2,6-二氯-3-氟苯乙醇的反应中,表现出了较好的重复使用稳定性。这种从细胞裂解液中无需纯化直接制备RP-CLEs的绿色方法可以进一步扩展到其他酶种,有望提升我们对酶精准固定化的理解和促进精细化学品或药物酶促生物催化合成。