牛结核病(Bovine tuberculosis, bTB)主要是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis, M. bovis)等引起的一种重要的人兽共患传染病。牛感染牛分枝杆菌后,主要诱导机体产生Thl型细胞免疫应答反应,其中白细胞介素-2是Thl型细胞免疫应答产生的主要细胞因子之一。牛白细胞介素-2(BoIL-2)是由特异性抗原或丝裂原刺激后,机体分泌的一种具有多种生物学活性的细胞因子,在机体免疫系统中发挥重要的调节作用。Ag85复合物是结核分枝杆菌一种主要的分泌蛋白,主要由三种分泌蛋白Ag85A、Ag85B和Ag85C组成。研究表明Ag85A可刺激机体产生Thl型细胞免疫应答,诱导IFN-γ、TNF-a和IL-2等细胞因子的分泌,是一种重要的免疫优势抗原。因此,本研究分别制备牛IL-2和牛分枝杆菌Ag85A的单克隆抗体,为牛结核病的预防与诊断等研究提供重要的生物材料。1.牛IL-2的原核表达及单克隆抗体的制备与鉴定从ConA刺激的健康奶牛外周血淋巴细胞中提取总RNA,应用RT-PCR方法反转录为cDNA作为模板,并扩增429 bp大小的目的基因。随后将目的基因分别与表达载体pET-30a(+)和pGEX-6p-1连接构建重组质粒。将鉴定正确的重组质粒转入宿主菌,分别构建pET-30a-BoIL-2/BL21 (DE3)和pGEX-6p-l-BoIL-2/BL21.对重组菌进行诱导表达后,SDS-PAGE鉴定结果显示目的条带大小分别为21 kDa和4l kDa,与预期大小相一致。Western Blot结果显示其具有良好的免疫反应性。以纯化融合蛋白rHis-BoIL-2免疫6周龄BALB/c小鼠,经三次免疫后,采用淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合。以纯化融合蛋白rGST-BoIL-2作为检测原,采用间接ELISA方法检测筛选阳性细胞克隆,经2次亚克隆,获得11株能稳定分泌特异性BoIL-2单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为1A3.1D3、2G7、 3C10、3D8、5D10、5F11、5G2、5G6、6D7和6E5。亚类鉴定结果显示,除1A3和6E5亚类为IgG2b型,2G7亚类为IgG2a型,3C10和5G2亚类为IgG3型,其余6株单抗的亚类均为IgG1型。效价测定结果显示,除3C10上清效价为1：2560,2G7和5G2的上清效价为1：5120外,其余细胞上清效价均在1.0×104以上,11株单抗腹水效价均在1.0×100-3.0×107之间。另外,11株单抗均与商品化大肠杆菌表达BoIL-2和毕赤酵母表达BoIL-2有较好的反应性。Western Blot结果显示所获得11株单抗均与融合蛋白rHis-BoIL-2和rGST-BoIL-2有反应,而与对照组pET-30a/BL21(DE3)和pGEX-6P-1/BL21空载体细菌不发生反应。特异性鉴定结果显示11株单抗只与相应的融合蛋白有反应,与其它重组细胞因子均无交义反应。流式检测结果显示3D8、5D10、6D7和6E5四株单抗与天然BoIL-2具有较好的反应性。2.牛分枝杆菌Ag85A单克隆抗体的制备与鉴定以纯化融合蛋白rGST-Ag85A作为免疫原,采用淋巴细胞杂交瘤技术制备稳定分泌牛分枝杆菌Ag85A抗体的杂交瘤细胞株。以纯化融合蛋白rHis-Ag85A作为检测原,采用间接ELISA检测方法,筛选阳性细胞克隆,经2次细胞亚克隆共获得9株能稳定分泌牛分枝杆菌Ag85A特异性单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为1C6、2E6、2F2、3B8、3D9、4B3、 4F3、5B9和6B5。亚型鉴定和效价测定结果显示,9株单抗均为IgG1型,腹水效价均在1.0×106-1.0×108之间,细胞上清效价均在1.0×104以上。Western Blot试验和IFA试验结果显示,9株单抗均与原核表达rHis-Ag85A、rGST-Ag85A,真核表达GFP-Ag85A,以及rBCG::Ag85A和wtBCG细菌中Ag85A抗原都有较好的特异性反应,单抗3D9与真核表达GFP-Ag85B和GFP-Ag85C有反应,单抗4B3与真核表达GFP-Ag85C有反应。综上所述,本研究共制备11株能稳定分泌抗BoIL-2特异性单抗和9株稳定分泌抗牛分枝杆菌Ag85A特异性单抗的杂交瘤细胞株。经鉴定BoIL-2单抗和Ag85A单抗均具有识别相应天然抗原的活性,为牛结核病的检测、诊断等研究提供了重要的生物材料。