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目的:探索适合多位点同步检测的SNP扩增方案和杂交检测条件,建立芯片杂交信号判读的标准。
方法:在计算机辅助程序的帮助下设计多重扩增的引物和探针;优化荧光标记引物的多重PCR条件。自行制备氨基化片基并点样制片,隔水密闭杂交,激光共聚焦扫描后判读检测结果。
结果:根据CAD设计和实验的结果,将8个PCR反应分为三组多重PCR。扩增条件为:预变性94℃ 5min;35次循环:变性94℃ 30see,退火.59℃ 30sec,延伸72℃40see 延伸72℃5min。在20uL反应体系中,含有dNTP各200μmol/L,基因组DNA 40ng,1×PCR缓冲液和0.5UTaq酶。以SSPE杂交液1:9与多重扩增产物混合可以与探针产生较理想的杂交信号。根据合成的野生/突变型模板及基因组杂交的实验结果,认为野生/突变探针杂交信号比值大于4或小于2.5对分型结果的判断有意义,而当信号值在2.5-4范围内应重新检测分析。
结论:通过多片段同步扩增和不同位点平衡杂交的实现,以及提高杂交信号强度,证明该技术在流行病学调查上具有可行性,体现了寡核苷酸芯片对药物代谢酶多态性基因分型的优势。要在寡核苷酸合成和保管、反应体系的一致性、以及质量控制等环节予以严格控制,保证试验的稳定性和准确度。